Трикотажная одежда для дома и отдыха для мужчин и женщин, в интернет магазине Ирис — домашний трикотаж!

Домашний трикотаж от производителя в Иваново, в интернет-магазине «Ирис — домашний трикотаж» Трикотаж дешево, купить ночные сорочки, купить туники, купить трикотаж

Разное

Сандра хеллберг: Сандра Хеллберг (Sandrah Hellberg) 36 фото | ThePlace

Содержание

Сандра Хеллберг (Sandrah Hellberg) 36 фото | ThePlace

Фотогалерея Сандра Хеллберг содержит 36 фото высокого качества. Дата последнего обновления в галерее 26 июл. 2012

Самые популярные фотографии Sandrah Hellberg (на основе голосования посетителей нашего сайта)

Сандра Хеллберг / фотогалерея

Если у вас есть интересные фото Сандра Хеллберг (Sandrah Hellberg), Вы можете загрузить их на нашем форуме.

Качественные фото будут добавлены в фотогалерею.

1 865×1114

2 860×1114

1 1156×1617

4 3000×2000

2 1148×1614

3 1492×2000

3 1492×2000

2 1232×1696

6 3000×2000

2 3000×2000

3 1489×2000

2 1492×2000

6 1492×2000

1 1497×2000

2 1492×2000

2 3000×2000

6 1237×1699

2 1501×2000

2 1492×2000

1500×2000

2 1497×2000

3 1500×2000

1 1500×2000

3 1571×2000

3 1571×2000

3 1571×2000

3 1571×2000

4 2667×2000

6 3143×2000

3 3143×2000

— проголосуй за фото Сандра Хеллберг (Sandrah Hellberg) (фото-рейтинг)

Sandrah Hellberg

Сандра Хеллберг

Сандра — картинки

Сандра — картинкигравитация вес сандра буллок сандра баллок скафандр космонавт

1920 x 1200, 232 кБ

во весь экрансохранитьbatman: arkham origins леди шива шива сандра ву сан- сандра вусан боец ниндзя взгляд перчатки плащ wb games montréal warner bros. interactive entertainment

1923 x 1200, 138 кБ

во весь экрансохранитьсандра шайн девушка грудь волосы попа киска

1600 x 1067, 413 кБ

во весь экрансохранитьсиськи грудь соски блеск позолота цепочка кулон w4b сандра

1920 x 1280, 395 кБ

во весь экрансохранитьсандра попка задница большая задница трусики

1920 x 1440, 523 кБ

во весь экрансохранитьсандра улыбка портрет прелесть

1920 x 1324, 282 кБ

во весь экрансохранитьсандра шайн купальник

1680 x 1050, 408 кБ

во весь экрансохранитьвенера и марс лондонская национальная галерея venus and mars сандро боттичелли sandro botticelli

2700 x 1080, 667 кБ

во весь экрансохранитьвелосипед сандра домбровский байк мотоцикл солнце

2188 x 1080, 287 кБ

во весь экрансохранитьсандра кармен девушка брюнетка взгляд

1920 x 1280, 150 кБ

во весь экрансохранитьсандра кубика девушка сок красивая улыбка

1920 x 1373, 300 кБ

во весь экрансохранитьсандра ножки взгляд кресло

1920 x 1280, 393 кБ

во весь экрансохранитьсандра хеллберг модель гламур моды макияж марки

1920 x 1222, 281 кБ

во весь экрансохранитьсандра хеллберг модель гламур макияж моды стиль марки аксессуары

1920 x 1222, 449 кБ

во весь экрансохранитьсандра хеллберг девушка модель сумка

1920 x 1264, 465 кБ

во весь экрансохранитьсандра хеллберг модель гламур моды макияж стиль марки аксессуары тенденции

1920 x 1440, 311 кБ

во весь экрансохранитьсандра хеллберг sandrah хеллберг сумка девушка модель туфли платье прическа серьги сережки

1920 x 1280, 499 кБ

во весь экрансохранитьсандра onofrei нелли лехтинен природа

1920 x 1278, 366 кБ

во весь экрансохранитьсандра onofrei нелли лехтинен подруги модели

1920 x 1278, 345 кБ

во весь экрансохранитьсандра onofrei платье лето

1920 x 1370, 460 кБ

во весь экрансохранитьсандра onofrei шапочка портрет

1920 x 1431, 309 кБ

во весь экрансохранитьсандра onofrei портрет взгляд

1920 x 1373, 273 кБ

во весь экрансохранитьсандра onofrei шапочка волосы ветер боке

1953 x 1080, 164 кБ

во весь экрансохранитьпортрет взгляд боке сандра onofrei

1920 x 1327, 291 кБ

во весь экрансохранить

Ещё картинки

открыть корзинуочистить корзину

Модные модели (76 фото)

Модели в стильной одежде


Marciano guess новая коллекция


Барбара Палвин 2020


Модельные Наряды


Эмили Дидонато Луки


Candice Swanepoel


Сандра Хеллберг (Sandrah Hellberg)


Фотомодели девушки блондинки


Манго 2015


Барбара Палвин стиль в одежде


Стильная одежда для девушек


Стильная одежда


Balmain 2019


Стильная одежда


Реклама Giuseppe Zanotti


Фотомодель в пиджаке


Модель Томми Хилфигер


Gucci пальто 2013


Фэшн съемка


Модная одежда


Супермодель Джиджи Хадид


Мика Джианелли


Модная женщина


Позы для моделей одежды


Жизель Бюндхен в пальто


Кара Делевинь с мокрыми волосами


Брендовая одежда для девушек


Барбара Палвин стиль лето


Саша Пивоварова в полный рост


Лара диор


Сандра Хеллберг фигура


Кара Делевинь бренды


Элегантная девушка


Fashion модели


Ассортимент женской одежды


Реклама одежды


Красивая одежда


Саша Пивоварова сейчас 2020


Девушка в костюме на улице


Модели одежды


Модель Барбара Фиальо


Сандра Хеллберг фото


Модель Джиджи Хадид


Барбара Палвин 2016


Фотосессия на улице


Стильная одежда для девушек


Вика Фалилеева модель


Модная женская одежда


Кампейн гуччи 1992


Элегантная женщина


Burberry 2000


Модная девушка


Роберто Кавалли с моделями


Вог макиатт


Модная одежда для девушек


Дольче Габбана дом моды в Италии


Современная одежда


Модные женские вещи


Стильные подруги


Стильная девушка в куртке


Красивая одежда


Женщина с сумкой


Фотосессия Джиджи Хадид 2020


Фотомодели модное на белом фото


Городской стиль в одежде


Стильная одежда


Сандра Хеллберг горячие


Костюмы для девушек модные


Стильная одежда для девушек


Стильная одежда для девушек


Anastasia Miranda


Яркий фэшн образ


Стильная фотомодель


Max Mara одежда


Саша Пивоварова в рекламах


Яркая женская одежда

Sandrah Hellberg (178 изображение загружатьs)

178 изображение загружатьs

Sandrah Hellberg

фото по biron14

Sandrah Hellberg

фото по anetta39

Sandrah Hellberg

фото по maybelle2

Sandrah Hellberg

фото по roger43

Sandrah Hellberg

фото по anica-366

Sandrah Hellberg

фото по ced

Sandrah Hellberg

фото по arte191

Sandrah Hellberg

фото по dar_23

Sandrah Hellberg

фото по sabina9

Sandrah Hellberg

фото по woodie2

Sandrah Hellberg

фото по woodrow9

Sandrah Hellberg

фото по lorenzo-25

Sandrah Hellberg

фото по merilyn-5

Sandrah Hellberg

фото по karalee

Sandrah Hellberg

фото по filmore548

Sandrah Hellberg

фото по oralla409

Sandrah Hellberg

фото по calida10

Sandrah Hellberg

фото по gisela-246

Sandrah Hellberg

фото по giordano

Sandrah Hellberg

фото по claudine5

Sandrah Hellberg

фото по morganica

Sandrah Hellberg

фото по eugine_37

Sandrah Hellberg

фото по corny37

Sandrah Hellberg

фото по dina

Sandrah Hellberg

фото по arte191

Sandrah Hellberg

фото по alvin428

Sandrah Hellberg

фото по hilliary

Sandrah Hellberg

фото по vernor-44

Sandrah Hellberg

фото по isiahi31

Sandrah Hellberg

фото по marian41

Sandrah Hellberg

фото по tilly14

Sandrah Hellberg

фото по carmita8

Sandrah Hellberg

фото по emmeline5

Sandrah Hellberg

фото по grant

Sandrah Hellberg

фото по tilly14

Sandrah Hellberg

фото по esra

Sandrah Hellberg

фото по tracee1

Sandrah Hellberg

фото по cristiano

Sandrah Hellberg

фото по betteanne

Sandrah Hellberg

фото по william167

Sandrah Hellberg

фото по ebeneser12

Sandrah Hellberg

фото по ennis3

Sandrah Hellberg

фото по irina6

Sandrah Hellberg

фото по karlen-44

Sandrah Hellberg

фото по vernor-44

Sandrah Hellberg

фото по lynn

Sandrah Hellberg

фото по corine14

Sandrah Hellberg

фото по hastings

Sandrah Hellberg

фото по charil

Sandrah Hellberg

фото по claudina

Sandrah Hellberg

фото по kristo

Sandrah Hellberg

фото по corny37

Рекламная кампания Guess Accessories

{«items»:[«5fd1a5dd0e8f5f0017db23ac»,»5fd1a5dd0e8f5f0017db23ab»,»5fd1a5dd0e8f5f0017db23aa»,»5fd717e557158200173061e6″,»5fd717e557158200173061e5″,»5fd717e557158200173061e7″],»styles»:{«galleryType»:»Columns»,»groupSize»:1,»showArrows»:true,»cubeImages»:true,»cubeType»:»max»,»cubeRatio»:1. 7777777777777777,»isVertical»:true,»gallerySize»:30,»collageAmount»:0,»collageDensity»:0,»groupTypes»:»1″,»oneRow»:false,»imageMargin»:5,»galleryMargin»:0,»scatter»:0,»rotatingScatter»:»»,»chooseBestGroup»:true,»smartCrop»:false,»hasThumbnails»:false,»enableScroll»:true,»isGrid»:true,»isSlider»:false,»isColumns»:false,»isSlideshow»:false,»cropOnlyFill»:false,»fixedColumns»:0,»enableInfiniteScroll»:true,»isRTL»:false,»minItemSize»:50,»rotatingGroupTypes»:»»,»rotatingCropRatios»:»»,»columnWidths»:»»,»gallerySliderImageRatio»:1.7777777777777777,»numberOfImagesPerRow»:3,»numberOfImagesPerCol»:1,»groupsPerStrip»:0,»borderRadius»:0,»boxShadow»:0,»gridStyle»:0,»mobilePanorama»:false,»placeGroupsLtr»:true,»viewMode»:»preview»,»thumbnailSpacings»:4,»galleryThumbnailsAlignment»:»bottom»,»isMasonry»:false,»isAutoSlideshow»:false,»slideshowLoop»:false,»autoSlideshowInterval»:4,»bottomInfoHeight»:0,»titlePlacement»:[«SHOW_ON_THE_RIGHT»,»SHOW_BELOW»],»galleryTextAlign»:»center»,»scrollSnap»:false,»itemClick»:»nothing»,»fullscreen»:true,»videoPlay»:»hover»,»scrollAnimation»:»NO_EFFECT»,»slideAnimation»:»SCROLL»,»scrollDirection»:0,»scrollDuration»:400,»overlayAnimation»:»FADE_IN»,»arrowsPosition»:0,»arrowsSize»:23,»watermarkOpacity»:40,»watermarkSize»:40,»useWatermark»:true,»watermarkDock»:{«top»:»auto»,»left»:»auto»,»right»:0,»bottom»:0,»transform»:»translate3d(0,0,0)»},»loadMoreAmount»:»all»,»defaultShowInfoExpand»:1,»allowLinkExpand»:true,»expandInfoPosition»:0,»allowFullscreenExpand»:true,»fullscreenLoop»:false,»galleryAlignExpand»:»left»,»addToCartBorderWidth»:1,»addToCartButtonText»:»»,»slideshowInfoSize»:200,»playButtonForAutoSlideShow»:false,»allowSlideshowCounter»:false,»hoveringBehaviour»:»NEVER_SHOW»,»thumbnailSize»:120,»magicLayoutSeed»:1,»imageHoverAnimation»:»NO_EFFECT»,»imagePlacementAnimation»:»NO_EFFECT»,»calculateTextBoxWidthMode»:»PERCENT»,»textBoxHeight»:26,»textBoxWidth»:200,»textBoxWidthPercent»:65,»textImageSpace»:10,»textBoxBorderRadius»:0,»textBoxBorderWidth»:0,»loadMoreButtonText»:»»,»loadMoreButtonBorderWidth»:1,»loadMoreButtonBorderRadius»:0,»imageInfoType»:»ATTACHED_BACKGROUND»,»itemBorderWidth»:0,»itemBorderRadius»:0,»itemEnableShadow»:false,»itemShadowBlur»:20,»itemShadowDirection»:135,»itemShadowSize»:10,»imageLoadingMode»:»BLUR»,»expandAnimation»:»NO_EFFECT»,»imageQuality»:90,»usmToggle»:false,»usm_a»:0,»usm_r»:0,»usm_t»:0,»videoSound»:false,»videoSpeed»:»1″,»videoLoop»:true,»jsonStyleParams»:»»,»gallerySizeType»:»px»,»gallerySizePx»:1000,»allowTitle»:true,»allowContextMenu»:true,»textsHorizontalPadding»:-30,»itemBorderColor»:{«themeName»:»color_12″,»value»:»rgba(239,239,239,0)»},»showVideoPlayButton»:true,»galleryLayout»:2,»calculateTextBoxHeightMode»:»MANUAL»,»targetItemSize»:1000,»selectedLayout»:»2|bottom|1|max|true|0|true»,»layoutsVersion»:2,»selectedLayoutV2″:2,»isSlideshowFont»:true,»externalInfoHeight»:26,»externalInfoWidth»:0. 65},»container»:{«width»:220,»galleryWidth»:225,»galleryHeight»:0,»scrollBase»:0,»height»:null}}

Фото модель — топ модель фото, фото моделей девушек – ФотоКто

Мы отобрали самых горячих супермоделей за 2013 год и подготовили эту подборку, чтобы Вы насладились просмотром фотографий удивительно красивых девушек.

Конечно, у Вас может быть свое мнение о том, как должен выглядеть этот рейтинг. Но нет сомнений в том, что в него вошли по-настоящему сногсшибательные красавицы. Приятнейшего просмотра!

25. Арманда Бартен (Armanda Barten)

25. Арманда Бартен (Armanda Barten)

Если Вы относитесь к числу тех людей, которые испытывают слабость к голландским супермоделям, то потрясающая блондинка Арманда Бартен из Нидерландов не могла ускользнуть от Вашего внимания. Так и хочется посетить Амстердам, откуда родом эта красавица. Она стала новым лицом линии нижнего белья Femilet, в котором выглядит безупречно.

24. Елена Сантарелли (Elena Santarelli)

24.  Елена Сантарелли (Elena Santarelli)

Возможно, Вы впервые слышите об этой суперкрасавице. Это означает, что Вы родом не из Италии, где она чрезвычайно популярна, как супермодель и телеведущая. Елена лишь однажды блистала у нас на сайте, но это была исключительная фотосессия, снимки из которой получились великолепные. У этой итальянской модели есть особая примета — кокетливая татуировка на правом плечике.

23. Кэролайн Коринф (Caroline Corinth)

23. Кэролайн Коринф (Caroline Corinth)

Кэролайн это свежее лицо от Victoria’s Secret. Она родом из Дании и такая же милая, как и Эрин Хизертон, а это о многом говорит. У нее безупречное тело и эта девушка в нижнем белье и в купальниках выглядит потрясающе. Мы надеемся, что она продолжит сотрудничать с VS и еще не раз порадует нас новыми фотосетами.

22. Нерея Арс (Nerea Arce)

22. Нерея Арс (Nerea Arce)

Нерея относится к тем девушкам, которые вызывают любовь с первого взгляда. Ее гипнотизирующая красота никого не оставляет равнодушным. Эта супермодель из Испании удивительно хороша в сексуальных бикини, но нет сомнений в том, что она невероятно привлекательно выглядит даже в самых обыкновенных нарядах.

21. Анна-Мария Соболевска (Anna Maria Sobolewska)

20. Марина Моззони (Marina Mozzoni)

Еще одна сексуальная латиноамериканка из Аргентины, которая выглядит совершенно удивительно, когда позирует в изящном нижнем белье. Эта девушка стала новым лицом линейки нижнего белья от Simone Perele. От каждого снимка Марины Моззони захватывает дух.

19. Сандра Хеллберг (Sandrah Hellberg)

19. Сандра Хеллберг (Sandrah Hellberg)

Наверняка, многие из Вас узнали супермодель Сандру Хеллберг, так как эта красавица позировала для Guess и других известных брендов. Мы несказанно рады открытию этой шведской красавицы и с нетерпением ожидаем появления ее новых фотографий.

18. Джулия Перейра (Julia Pereira)

18. Джулия Перейра (Julia Pereira)

Мы уже не раз отмечали, что многие девушки, которые входят в число самых горячих супермоделей, родом из Бразилии. Джулия Перейра как раз одна из пяти новых бразильских моделей, которые отличаются исключительной красотой.

17. Лара Альварес (Lara Alvarez)

17. Лара Альварес (Lara Alvarez)

Это еще одна девушка, которая всего один раз появилась у нас на сайте в прошедшем году, но ее снимки оставили самое неизгладимое впечатление. Лара Альварес хорошо известна в Испании, как телеведущая. И, судя по фотографиям, она великолепная модель. В нижнем белье эта девушка неотразима.

16. Оливия Гарсон (Olivia Garson)

16. Оливия Гарсон (Olivia Garson)

Оливия Гарсон готова потеснить красавицу Кэндис Свейнпол. Это новая модель из Южной Африки, которая стремительно завоевывает популярность в мире моды. Она также потрясающе выглядит в купальных костюмах. Глядеть на ее фотографии это истинное удовольствие.

15. Рэйчел Мортенсон (Rachel Mortenson)

15. Рэйчел Мортенсон (Rachel Mortenson)

Торговая марка Frederick’s of Hollywood отличается безупречным вкусом, когда речь заходит о подборе моделей. И Рэйчел Мортенсон яркое тому подтверждение. Мы никогда ранее не слышали об этой супермодели из США, пока она не стала рекламировать коллекцию нижнего белья от FOH. К счастью, она уже снялась в нескольких фотосессиях для этой торговой марки.

14. Дебора Мейс (Deborah Mace)

14. Дебора Мейс (Deborah Mace)

Это еще одна очаровательная модель с блестящим будущим. Дебора Мейс родом из Франции. Она не отличается пышными формами, как многие другие супермодели, но у нее потрясающая улыбка, которая добавит Вам солнечного настроения.

13. Илиана Папагеоргиу (Iliana Papageorgiou)

13. Илиана Папагеоргиу (Iliana Papageorgiou)

Наш рейтинг самых горячих девушек не может обойтись без греческой богини, о существовании которой мы узнали в 2013 году. Ее зовут Илиана Папагеоргиу. Глаза, губы и соблазнительные формы этой девушки выглядят божественно. К сожалению, мы видели лишь одну фотосессию с этой суперкрасавицей, но надеемся, что в следующем году нас ждут новые снимки с Илианой.

12. Ольга Рзеплинска (Olga Rzeplinska)

12. Ольга Рзеплинска (Olga Rzeplinska)

Польские супермодели заслуженно завоевали всеобщую любовь. Ольга Рзеплинска это еще один образец девушки удивительной красоты из Польши. Ее фамилию сложно запомнить, но внешность у этой блондинки незабываемая.

11. Вероника Ассис (Veronica Assis)

11. Вероника Ассис (Veronica Assis)

Чем ближе мы подбираемся к первому месту, тем сложнее нам приходится.  Совершенство по имени Вероника Ассис восхищает своей потрясающей внешностью. Она невероятно очаровательная и сексуальная. Наслаждайтесь!

10. Сандра Кубика (Sandra Kubicka)

10. Сандра Кубика (Sandra Kubicka)

Голубоглазая Сандра Кубика невероятно милая и сладкая красавица, ставшая очередным открытием в модельном бизнесе. Ее можно сравнить с Барбарой Палвин и Ниной Агдал. Сандра удивительная девятнадцатилетняя модель из Польши, о которой мы еще не раз услышим в ближайшие годы.

9. Луиза Фрейеслебен (Luiza Freyesleben)

9.  Луиза Фрейеслебен (Luiza Freyesleben)

Мы не станем долго расписывать красоту Луизы Фрейеслебен. Всего за несколько месяцев мы трижды публиковали снимки из разных фотосессий этой бразильской супермодели. На самом деле она потрясающая красавица. Непременно посмотрите ее фото у нас на сайте, если Вы их еще не видели.

8. Мария Виноградова (Mariya Vinogradova)

8. Мария Виноградова (Mariya Vinogradova)

Вам нравится Ирина Шейк? Появилась новая русская супермодель, которая выглядит так же великолепно. Мария Виноградова очень близка к определению совершенства. Она бы оказалась еще выше в этом рейтинге, если бы у нас было больше ее снимков. Мы лишь один раз публиковали фотографии с Марией, и от них буквально захватывает дух.

7. Саманта Градовилль (Samantha Gradoville)

7. Саманта Градовилль (Samantha Gradoville)

Имя Саманты Градовилль уже очень хорошо известно в мире модельного бизнеса. Многие знаменитые дизайнеры хотят работать с этой невероятной девушкой. Удивительно чувственная супермодель с идеальным телом родом из США. Она великолепна на всех фотографиях, которые мы видели.

6. Натали Моррис (Natalie Morris)

6. Натали Моррис (Natalie Morris)

Это еще одна прекрасная девушка из США. Натали Моррис счастливая обладательница прекрасного тела. Можно лишиться дара речи, глядя как она позирует в соблазнительном нижнем белье.

5. Даниэла Брага (Daniela Braga)

5. Даниэла Брага (Daniela Braga)

Имя этой бразильской красавицы Вам обязательно запомнится, так как в ближайшие годы она непременно будет мелькать у нас на сайте. Первыми ее обнаружили агенты из Victoria’s Secret и она сразу же стала демонстрировать белье этого популярного бренда. Эта девушка настолько удивительная, сексуальная и милая, что в нее можно влюбиться с первого взгляда.

4. Danielly Silva

2. Тиффани Келлер (Tiffany Keller)

Эта девушка обошла всех других красавиц из США. Тиффани Келлер одна из красивейших современных супермоделей на планете. Она потрясающе выглядит в нижнем белье, в купальниках и в любой другой одежде. Особенно хороша эта модель в образе сексуальной невесты.

1. Алехандра Алонсо (Alejandra Alonso)

1. Алехандра Алонсо (Alejandra Alonso)

Из всего обилия удивительно красивых девушек мы отдали первое место именно этой сногсшибательной супермодели из Испании. Она настолько чувственная и сладкая, что любой парень мог бы сподвигнуться на изучение испанского языка, чтобы написать ей любовное письмо.

Источник:http://cameralabs.org/

Идеи подарков на Новый Год от Guess. Праздничная коллекция аксессуаров 2012

Близится любимый всеми праздник — Новый год и приходит время подумать о приобретении подарков своим близким, подругам, да и себя побаловать не помешало бы! Сегодня я хотела бы поделиться с вами стильными аксессуарами из праздничной коллекции 2012 от бренда Guess, которые представляют собой отличное решение идеи подарков на Новый Год.

На этот раз бренд демонстрирует великолепный и красочный lookbook, наполненный солнечными  изображениями, где fashion модель Сандра Хеллберг (Sandrah Hellberg), появляется в восхитительных купальниках в дуэте со стильными и шикарными сумками и роскошной элегантной обувью.

Пара фотографов, работавших над созданием lookbook’a —  Claudia и Ralf Pulmanns полностью воплотили отличные идеи подарков на Новый Год от бренда Guess, передав красочную атмосферу и желание стать частью данной красоты.

Стилистом выступила Martina Nilsson, придавшая еще больше чувственности Сандре Хеллберг и проработавшая концепцию фотосъемки. Прическами занимался Peter Savic, создавший восхитительный объем и наполненные движением локоны, а макияжем — Devra Kinery, которая подчеркнула природную красоту модели.

 

границ | Прогестерон подавляет иммунные реакции в активированных in vitro CD4 + Т-клетках и влияет на гены, связанные с аутоиммунными заболеваниями, которые улучшаются во время беременности

Введение

Беременность представляет собой уникальное иммунологическое состояние, поскольку иммунная система матери способна переносить присутствие полуаллогенного плода . Считается, что эта иммунологическая толерантность возникает из-за обширных иммунных и эндокринных изменений, вызванных во время беременности (1, 2), которые контролируются повышенными уровнями стероидных гормонов, таких как прогестерон (P4), которые необходимы для установления и поддержания беременности (3– 5).Соответственно, низкие уровни P4 были связаны с несколькими осложнениями беременности (6-8), а лечение антагонистом P4-рецепторов мифепристоном (RU486) приводит к прерыванию беременности (9), что еще раз подтверждает важность P4 во время беременности. Интересно, что терапевтическое использование P4 во время беременности снижает риск преждевременных родов в определенных группах риска (10), что подчеркивает потенциальное использование P4 в качестве лечения осложнений беременности.

Роль P4 в основном связана с его влиянием на гомеостаз и ремоделирование миометрия (11).Однако на важную иммуномодулирующую роль P4 in vivo указывает улучшение, связанное с беременностью, и последующее ухудшение аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз (РС) и ревматоидный артрит (РА), которые совпадают с временными точками во время беременности. и после беременности, когда уровень P4 самый высокий и самый низкий, соответственно (12–14). Кроме того, наблюдались различия в иммунных ответах, связанных с высоким и низким уровнями P4 во время менструального цикла (15, 16).Предыдущие исследования иммунно-эндокринных взаимодействий в значительной степени были сосредоточены на том, как эстроген влияет на иммунную систему. Интересно, что уровни эстрогена увеличиваются и уменьшаются во время беременности так же, как P4, хотя эстроген, по-видимому, обладает как иммунорегулирующими, так и иммуноактивирующими свойствами (17). Действительно, эстроген был предложен в качестве основного фактора, объясняющего учащение аутоиммунных заболеваний у женщин (18). С другой стороны, in vitro эффекты P4 на разные популяции иммунных клеток подтверждают ключевую роль P4 в регуляции иммунных ответов, которые могут быть центральными для обеспечения толерантности плода (19-24).Более того, роль P4 как мощного иммуносупрессора подтверждается исследованиями in vivo , показывающими участие P4 в ответ на аллогенную и ксеногенную трансплантацию (25–27) и отторжение трансплантата у людей (28).

CD4 + Т-клетки являются центральными в иммунной системе, выступая в качестве главных регуляторов иммунитета и толерантности (29). Важность CD4 + Т-клеток во время беременности очевидна по их относительному исключению из взаимодействия плода и матери, чтобы ограничить потенциально вредную активацию (30), тогда как регуляторные Т-клетки обогащены, тем самым еще больше ограничивая вредные Т-клеточные ответы (31 , 32).Параллельно ограничение активации Т-клеток CD4 + является важным аспектом при заболеваниях, опосредованных Т-клетками, поскольку аберрантная активация аутореактивных Т-клеток CD4 + является центральным механизмом в патогенезе заболевания (33). Таким образом, регуляция Т-клеток CD4 + является общим знаменателем, который может предотвращать нежелательные материнские иммунные ответы на плод, а также объяснять улучшение аутоиммунных заболеваний во время беременности. Интересно, что P4, как было показано, ограничивает активацию Т-клеток CD4 + (34–36). Однако углубленный анализ точного воздействия P4 на активацию Т-клеток CD4 + человека и его потенциального участия в модуляции заболевания во время беременности все еще отсутствует.

Здесь мы сообщаем подробные данные секвенирования РНК, демонстрирующие глубокое прямое влияние P4 на активацию Т-клеток. Более конкретно, большие P4-индуцированные транскриптомные изменения были наиболее заметно подавляющими для иммуно-ассоциированных генов и путей, в то время как P4 активировал в основном неиммунные гены.Интересно, что эти иммунные гены, подавляемые P4, были значительно обогащены генами, связанными с заболеваниями, которые, как известно, модулируются во время беременности, включая MS и RA. Эффекты на несколько из этих связанных с заболеванием генов были дополнительно подтверждены на уровне белка с использованием анализа расширения близости. Наши результаты подтверждают, что P4 является основным иммунорегулирующим гормоном во время беременности, и предполагают, что P4 может участвовать в улучшении некоторых аутоиммунных заболеваний, вызванных беременностью, тем самым представляя потенциальную возможность для будущих вариантов лечения.

Материалы и методы

Объекты исследования

Образцы крови были взяты у тринадцати здоровых женщин-добровольцев (средний возраст 32 года, 25-43 года), набранных среди студентов и персонала Университета Линчёпинга и больницы Университета Линчёпинга, Швеция. Информированное согласие было получено до сбора образцов, и исследование было одобрено Региональным советом по этике в Линчёпинге (Regionala etikprövningsnämnden i Linköping), Швеция (номер одобрения: M39-08). На момент включения ни одна из женщин не использовала гормональные контрацептивы или какие-либо другие лекарства.Моменты сбора образцов были равномерно распределены по менструальному циклу (предполагая, что менструальный цикл длился 28 дней; семь женщин находились в лютеиновой фазе и шесть — в фолликулярной фазе). Не было различий в ответе на P4 (на основе кратного снижения экспрессии CD69 у женщин в лютеиновой и фолликулярной фазах (данные не показаны). выделены градиентным центрифугированием с использованием Lymphoprep ™ (Axis-Shield, Осло, Норвегия) и трижды промыты в сбалансированном солевом растворе Хэнка (Life Technologies, Дармштадт, Германия).Магнитно-активированная сортировка клеток (MACS) была использована для выделения CD4 + Т-клеток. PBMC ресуспендировали в буфере MACS (фосфатно-солевой буфер, PBS; Medicago, Упсала, Швеция) с добавлением 2 мМ ЭДТА (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 0,5% фетальной бычьей сыворотки (FBS; Cytivia (ранее GE Healthcare Life). Sciences) HyClone ™, Уппсала, Швеция) и клетки CD4 + выделяли с помощью положительной иммуномагнитной селекции с использованием колонок MS и сепаратора miniMACS (Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Германия) в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем.Чистоту выделенных CD4 + Т-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии (средняя чистота 98,5%, диапазон 97,6-99,0%).

Предварительная инкубация с прогестероном

Выделенные CD4 + Т-клетки предварительно инкубировали с 10, 30 и 50 мкМ P4 (водорастворимый; Sigma Aldrich) или без него (только среда для культивирования клеток). Клетки высевали в 24-луночные планшеты с плоским дном (Costar ™; Corning Inc, Корнинг, Нью-Йорк, США) при 1,0 × 10 6 клеток / мл, в конечном объеме 1 мл / лунку среды Дульбекко, модифицированной Isocove (IMDM ; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) с добавлением L-глутамина (292 мг / л; Sigma-Aldrich), незаменимых аминокислот MEM 100X (10 мл / л; Gibco ® ), пенициллина (50 IE / мл ), стрептомицин (50 мкг / мл; Cambrex-Lonza, Базель, Швейцария) и бикарбонат натрия (3.024 г / л; Sigma-Aldrich) и 5% FBS и инкубировали при 37 ° C и 5% CO 2 . Через 20 часов клетки удаляли с планшетов, центрифугировали и ресуспендировали в среде для культивирования клеток перед стимуляцией in vitro . См. Рисунок 1A для обзора экспериментального дизайна исследования.

Рисунок 1 Прогестерон подавляет активацию Т-клеток и индуцирует транскриптомные изменения в активированных Т-клетках CD4 + . (A) Первичные CD4 человека + Т-клетки были выделены от здоровых небеременных женщин (n = 13) и предварительно инкубированы с или без различных концентраций (10, 30 и 50 мкМ) P4 в течение 20 часов, а затем культивированные неактивированные или активированные in vitro со связанными с планшетом анти-CD3 и анти-CD28 антителами в присутствии или в отсутствие P4 в течение 6-24-72 часов.Образцы, культивированные в течение 72 часов, использовали только для измерения секретируемых белков. Влияние Р4 на активацию Т-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии, секвенирования РНК и анализа близости секретируемых белков в супернатантах культур. (B – D) Влияние P4 на маркеры активации Т-клеток CD69 (6 и 24 часа) и CD25 (только 24 часа) анализировали с помощью проточной цитометрии (n = 11-13). Гистограммы показывают процентное содержание Т-клеток CD4 + , экспрессирующих маркеры активации Т-клеток. Показано среднее ± стандартное отклонение.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001. (E, F) Анализ многомерного масштабирования данных экспрессии генов, полученных с помощью секвенирования РНК (n = 3 неактивированных, n = 8 активированных с 50 мкМ P4 и без них). Группы выделяются цветом фона только для схематических целей. (G, H) Volcano графики транскриптомного анализа дифференциально экспрессируемых генов в CD4 + T-клетках, активированных в присутствии P4 по сравнению с отсутствием P4. Черные точки FDR ≤ 0.05. P4, прогестерон.

In vitro Активация CD4 + Т-клеток в отсутствие или в присутствии прогестерона

Двадцать четыре луночные планшеты с плоским дном покрывали 0,1 мкг / мл низкоэндотоксиновых анти-CD3 и анти-CD28 антител ( clone UCHT1, клон YTH913.12; Bio-Rad AbD Serotec Limited, Hercules, CA, USA) или только PBS в течение 20 часов при 4 ° C с последующей трехкратной промывкой в ​​PBS. Концентрация антител была выбрана на основании экспериментов по титрованию, где 0.1 мкг / мл приводил к умеренно повышенной экспрессии на клеточной поверхности маркера ранней активации Т-клеток CD69. Т-клетки CD4 + , предварительно инкубированные без P4, культивировали неактивированными или активированными (с антителами против CD3 / CD28), тогда как Т-клетки CD4 + , предварительно инкубированные с P4, были активированы в присутствии тех же концентраций, что и во время предварительной инкубации в течение 6-24-72 часов и последующей обработки для проточной цитометрии, экстракции РНК или измерения секретируемых белков. Клетки, культивированные в течение 72 часов, использовали только для измерения белка.Вкратце, после культивирования супернатанты собирали и замораживали при -70 ° C. Часть клеток использовали для анализа проточной цитометрии, а остальные лизировали и гомогенизировали в буфере RLT Plus (Qiagen; Hilden, Германия) с добавлением 143 мМ β-меркаптоэтанола (Sigma Aldrich) и гомогенизировали с помощью шприца и иглы в соответствии с инструкции, предоставленные производителем. Перед экстракцией лизаты хранили при -70 ° C. Жизнеспособность клеток после культивирования составила 87,6% ± 2,7 (среднее ± стандартное отклонение (SD)) через 6 часов 83.1% ± 3,7 через 24 часа.

Оценка статуса активации с помощью проточной цитометрии

Т-клетки CD4 + ресуспендировали в фиксируемом пятне мертвых клеток LIVE / DEAD ™ (Invitrogen), разведенном 1: 500 в PBS + 0,1% FBS и окрашенном мышиным антителом против человека. CD4-FITC (клон SK3), CD69-APCCy7 (клон FN50), CD25-PE (клон 2A3) и CD3-APC (клон SK7; все от BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США). Клетки инкубировали в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре и промывали PBS + 0,1% FBS перед анализом проточной цитометрии.Десять тысяч CD4 + Т-клеток были собраны и проанализированы с использованием FACS Canto II (BD Biosciences) и версии 2.1 программного обеспечения Kaluza (Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США). Клетки были заблокированы в соответствии с прямым (FSC) и боковым рассеянием (SSC) и далее определены как CD3 + CD4 + (фигура S1). Пороговое значение для экспрессии CD69 было основано на его экспрессии в неактивированных CD4 + Т-клетках, а экспрессия CD25 была установлена ​​на основе контура идентифицированных отрицательных и положительных популяций.Кратное изменение экспрессии CD69 и CD25 рассчитывали на основании экспрессии маркеров активации на клетках, активированных без P4 (клетки, активированные экспрессией, с P4 / клетки, активированные экспрессией, без P4). Все данные были проанализированы с помощью GraphPad Prism версии 8.0.1 (Сан-Диего, Калифорния, США). Большая часть данных была нормально распределена и поэтому анализировалась с использованием одностороннего дисперсионного анализа с тестом множественного сравнения Даннета. Данные выражены как среднее значение и стандартное отклонение. Статистически значимыми считались значения P ≤ 0,05.

Секвенирование РНК

РНК экстрагировали с использованием набора AllPrep DNA / RNA Mini (Qiagen) в соответствии с протоколом, предоставленным производителем, и РНК элюировали 30 мкл воды, свободной от РНКазы. Концентрацию РНК определяли с помощью спектрофотометра Nanodrop ® ND-1000 (Nanodrop Technologies Inc; Уилмингтон, Делавэр, США). Качество РНК контролировали с помощью набора Agilent RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) на приборе Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).Числа целостности РНК (RIN) составляли 9,5 ± 0,4 (среднее ± стандартное отклонение). Библиотеки были сконструированы с использованием мРНК TruSeq Stranded (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США), которые были адаптированы для работы на роботе Agilent BRAVO (Agilent Technologies) с 440 нг мРНК в качестве исходного материала на образец. Вкратце, мРНК, содержащую поли-А, выделяли с использованием шариков, покрытых поли-dT, и разбивали на фрагменты из 150-400 пар оснований путем химической фрагментации и превращали в кДНК с помощью обратной транскриптазы и случайного праймера. Ферменты и более короткие фрагменты удаляли с использованием гранул AMPure XP (Beckman Coulter, Индианаполис, Индиана, США).Остальные фрагменты аденилировали с последующим лигированием индекс-адаптеров и амплифицировали с помощью ПЦР. Образцы кодировали штрих-кодом, объединяли и секвенировали на платформе Illumina NovaSeq 6000 с проточной ячейкой S1 и секвенировали PE2x101 bp. В среднем 48,9 миллиона считываний было получено на образец (48,9 × 10 6 ± 10,5 × 10 6 , среднее значение ± стандартное отклонение). Файлы базовых вызовов за цикл были демультиплексированы и преобразованы в FASTQ с использованием bcl2fastq v2.19.1.403 из программного пакета CASAVA (Illumina). Подготовка библиотеки и секвенирование проводились в Национальной инфраструктуре геномики, лаборатории науки для жизни, Стокгольм.Парные образцы от в общей сложности восьми человек (всего n = 38 образцов) были использованы для секвенирования РНК (RNA-seq).

Анализ данных секвенирования РНК

Файлы FASTQ были обработаны с помощью TrimGalore! для удаления загрязнений адаптера и обрезки некачественных участков. Считывания с парных концов были сопоставлены и сопоставлены с ансамблем эталонного генома человека GRCh47 (Genome Reference Consortium Human Build 37) с использованием STAR (версия 2.5.3.a) (37). Счетчики чтения генов были получены с помощью StringTie (версия 1.3.3) (38). Обработку данных проводили в R Studio (R version 4.0; Бостон, Массачусетс, США) с использованием пакетов edgeR (39, 40) и limma (41, 42). Картированные чтения были отфильтрованы для генов с низкой экспрессией (сохранялись гены с количеством на миллион> 1 по крайней мере в 3-х повторах) и использованы для дальнейшего анализа. Количество отфильтрованных генов нормализовали с использованием усеченного среднего значения M через calcNormFactors в edgeR. Преобразование Voom применяли до анализа дифференциальной экспрессии. Коэффициент ложного открытия (FDR; Бенджамини-Хохберг) 0.05 использовали в качестве порога для дифференциально экспрессируемых генов (DEG). Дифференциальную экспрессию, индуцированную P4, рассчитывали, сравнивая CD4 + Т-клетки, активированные в присутствии или в отсутствие P4 и называемые генами ответа P4.

Путь, анализ обогащения набора генов и перекрытие генов

Для изучения биологической значимости DEGs, анализ обогащения набора генов (GSE) с использованием gseKEGG и анализ пути с использованием enrichKEGG от clusterProfiler (43) на основе Киотская энциклопедия генов и геномов (KEGG) (44, 45).Для анализа GSE в качестве входных данных использовался предварительно ранжированный список DEG с P4-ответом (на основе logFoldChange (logFC), n = 3339 генов через 6 часов и n = 3725 генов), при этом гены, у которых отсутствовал идентификатор гена Entrez. были удалены перед анализом. Оценка обогащения (ES) была рассчитана для всех наборов генов и нормализована для размера набора генов (нормализованная оценка обогащения; NES) по среднему распределению 1000 пермутаций. Минимальный размер набора генов был установлен на 20, а максимальный — на 200 генов, тем самым исключая малые и очень большие наборы общих данных.Скорректированное значение p ≤ 0,05 (по Бенджамини-Хохбергу) считалось статистически значимым. Перекрытие генов между различными наборами генов было рассчитано с использованием пакета GeneOverlap в R (46).

Измерение секретируемых белков в супернатантах культур с использованием анализа Proximity Extension

Чтобы проверить центральные транскриптомные изменения на уровне белка, супернатанты культур, собранные через 6, 24 и 72 часа, анализировали на 92 белка, связанных с воспалением (панель Olink воспаления; https: // www.olink.com/products/inflampting/) с мультиплексным анализом расширения близости (PEA) в центре клинических биомаркеров, Лаборатория науки для жизни, Университет Упсалы, SE-751 85 Uppsala. Вкратце, 1 мкл клеточного супернатанта инкубировали с подобранными парами антител, связанных с уникальными олигонуклеотидами (бесконтактными зондами), специфичными для каждого биомаркера, подлежащего измерению. Близкое расположение зондов, связанных с их мишенями, приводит к гибридизации, которая с добавлением ДНК-полимеразы удлиняет олигонуклеотиды, создавая ДНК-ампликон, который можно обнаружить и количественно оценить с помощью количественной ПЦР в реальном времени (47).Четыре внутренних контроля были включены для контроля качества и для нормализации данных. Данные выражали в виде нормализованной экспрессии белка (NPX), произвольной единицы в логарифмической шкале 2 . Значениям ниже предела обнаружения была присвоена половина значения предела обнаружения. Белки, которые были обнаружены как минимум в 50% образцов в каждый момент времени, были включены в статистический анализ со следующими исключениями: CCL20 (40% обнаруживается через 24 часа), трансформирующий фактор роста (TGF) -β1 (40% обнаруживается через 24 часа). 72 часа) и фактор ингибирования лейкемии (LIF; 47% через 24 часа), где более половины образцов в группе только активации было обнаружено (8-10 из 10) и значительно выше, чем неактивированные образцы.Статистические различия были определены с использованием теста Фридмана и Бенджамини-Хохберга для корректировки множественных сравнений. Скорректированное значение p ≤0,05 считалось статистически значимым. Все данные были проанализированы с помощью GraphPad Prism версии 8.0.1.

Обогащенный анализ генов, ассоциированных с заболеванием

Гены, ассоциированные с заболеванием, для Хашимото (n = 141), болезни Грейвса (n = 245), MS (n = 801), псориаза (n = 580), RA (n = 1273), системная красная волчанка (СКВ; n = 817) и системный склероз (SS; n = 400) были получены из DisGeNET (48).Все гены болезни, которые не присутствовали в фоновом режиме (все гены, обнаруженные с помощью RNA-seq, n = 14363), были исключены из последующего анализа. Обогащенный анализ генов, связанных с заболеванием, среди генов, затронутых P4, был выполнен с использованием точного теста Фишера для вычисления значений p и отношения шансов для перекрытий. Гены ответа P4, которые использовались, включали уникально экспрессируемые гены, сочетающие DEG как через 6, так и через 24 часа (всего n = 2563 гена с пониженной регуляцией и n = 2403 гена с повышенной регуляцией).

Взаимодействия фактора транскрипции с мишенью

Взаимодействия фактора транскрипции (TF) с мишенью были получены с использованием TRRUST (49) и DoRothEA (50).Общее количество взаимодействий из TRRUST составило 9396 и 6620 из DoRothEA (включая взаимодействия с оценкой достоверности A и B), но ограничение взаимодействий TF, на которые значительно повлиял P4, привело к общему количеству 3124 взаимодействий. Мы использовали TF, на которые значительно влиял P4, а затем включили только те взаимодействия TF-мишени, где мишень также значительно подавлялась P4 и ассоциировалась с заболеванием, как установлено общими генами для всех заболеваний или между MS, псориазом и RA.Обогащение мишеней для STAT1 и STAT3 вычислялось с использованием точного теста Фишера, где мишени среди связанных с заболеванием генов, которые были подавлены P4, сравнивались с мишенями соответствующих TF среди всех генов, подавляемых P4. Для анализа TF-мРНК-белка мы объединили дифференциально экспрессируемые белки (DEP), полученные в результате измерения экспрессии 92 белков, связанных с воспалением, в супернатантах культур через 6-24-72 часа (n = 41). Эти белки были сопоставлены с соответствующей мРНК и, в более широком смысле, с известными взаимодействующими ТФ.

Результаты

Прогестерон подавляет активацию Т-клеток и влияет на транскриптомный профиль в активированных CD4

+ Т-клетках

Чтобы изучить влияние Р4 на Т-клетки CD4 + и активацию Т-клеток, мы установили в vitro , где первичные человеческие CD4 + Т-клетки были предварительно инкубированы с P4 перед активацией, что отражает ситуацию in vivo , когда Т-клетки будут постоянно подвергаться воздействию P4 до контрольного заражения антигеном.Затем клетки культивировали неактивированными или с обычно используемой комбинированной активацией через рецептор Т-клеток (анти-CD3) и костимулирующий CD28 (анти-CD28) в присутствии или в отсутствие P4 в течение 6, 24 и 72 часов (рис. 1A. ). Эти временные точки были выбраны, чтобы в основном уловить влияние P4 на клеточные и транскриптомные события, вовлеченные в активацию Т-клеток, ведущую к клональной экспансии и дифференцировке. Мы использовали уровень стимуляции от низкого до умеренного, измеренный по доле активированных Т-клеток, экспрессирующих маркеры поверхностной активации (6 часов CD69, среднее ± стандартное отклонение неактивированных: 0.2% ± 0,04, активировано: 15% ± 9,5; 24 часа CD69, неактивированный: 0,2% ± 0,07, активированный: 20% ± 9,4; 24 часа CD25, неактивированный: 6,5% ± 1,4, активированный: 16% ± 4,7) (Рисунки 1B – D). Активация Т-клеток CD4 + в присутствии различных концентраций P4 снижала уровень активации клеток дозозависимым образом, со снижением доли как клеток, экспрессирующих CD69, так и CD25, при воздействии самой высокой концентрации P4 (50 мкМ) привело к наибольшему общему снижению (6 часов: CD69 p <0.010 , изменение в 0,4 ± 0,1 раза по сравнению с активацией без P4 p <0,0001 ; 24 часа: CD69 p <0,001 , 0,4 ± 0,1-кратное изменение p <0,0001 и CD25 p <0,0001 , 0,5 ± 0,1-кратное изменение p <0,0001 ) (Рисунки 1B – D и Рисунок S2). Затем мы выполнили транскриптомный анализ с использованием RNA-Seq на CD4 + T-клетках, активированных в течение 6 и 24 часов в присутствии (50 мкМ P4) или в отсутствие P4 вместе с неактивированными клетками, чтобы получить подробную картину того, как T На активацию клеток влияет P4.Чтобы получить начальное понимание транскриптомных изменений в масштабе всего генома, мы выполнили неконтролируемую кластеризацию образцов с использованием многомерного масштабирования, которое показало четкие различия между клетками, активированными в присутствии или в отсутствие P4, а также по сравнению с неактивированными клетками (рисунки 1E, F). Действительно, анализ дифференциальной экспрессии показал, что Р4 индуцировал значительные изменения в профиле экспрессии генов активированных Т-клеток CD4 + как через 6, так и через 24 часа (по сравнению с активацией в отсутствие Р4), называемых генами ответа Р4.В общей сложности, воздействие P4 привело к 4276 DEG (FDR ≤0,05; 2080 повышенная регуляция и 2196 пониженная регуляция) через 6 часов и 4756 DEG (2340 повышенная регуляция и 2416 пониженная регуляция) через 24 часа (Рисунки 1G, H). .

Анализ обогащения набора генов показывает преимущественно подавляющий эффект прогестерона на иммунные пути, особенно влияющие на гены, связанные с активацией Т-клеток

Чтобы получить более полное представление о функциональном значении генов ответа P4, мы провели анализ GSE.Некоторые иммунные пути, связанные с передачей сигналов Т-лимфоцитами и ниже по ней, были значительно подавлены Р4 как через 6, так и через 24 часа, например, передача сигналов рецептора Т-клеток, передача сигналов JAK-STAT, взаимодействия цитокин-цитокиновый рецептор, а также многие иммуноассоциированные пути заболевания (Рисунки 2A, B и Таблица S1). Через 24 часа несколько путей, связанных с дифференцировкой Т-клеток (дифференцировка T H 1, T H 2 и T H 17), также были затронуты P4. Поразительно, но анализ GSE показал, что очень мало путей активируется с помощью P4, хотя было почти равное количество генов ответа P4, которые были активированы или подавлены.Более того, ни один из активированных путей не был иммунным (Таблица S1). Поскольку нами и другими исследователями было обнаружено, что P4 оказывает подавляющее действие на активацию Т-клеток, мы исследовали, связаны ли изменения, вызванные P4, с генами, участвующими в самом процессе активации Т-клеток. Поэтому мы оценили, может ли P4 противодействовать изменениям, вызванным во время активации, анализируя перекрытие между генами ответа P4 и генами, участвующими в активации Т-клеток, , то есть генов, дифференциально экспрессируемых в активированных по сравнению с неактивированными Т-клетками.Действительно, наблюдалось поразительное совпадение между DEG, которые активируются во время активации Т-клеток и подавляются P4 (6 часов: отношение шансов (OR): 9,1, p = 2,6×10 -220 ; 24 часа: OR: 16,1, p = 1,6 x10 -481 ; фиг. 2C) и между DEG, подавляющими во время активации Т-лимфоцитов и активируемыми P4 (6 часов: OR: 4,4, p = 1,6×10 -125 ; 24 часа: OR: 5,1, p = 5,9×10 -195 ; фигура 2D), демонстрируя, что P4 значительно влияет на гены, связанные с фактической активацией Т-клеток, противодействуя некоторым изменениям, индуцированным во время активации.Напротив, несколько генов одновременно активировали или подавляли активацию как Р4, так и Т-клеток (данные не показаны).

Рисунок 2 Прогестерон подавляет иммунные пути во время активации CD4 + Т-клеток. (A, B) Гистограммы, показывающие нормализованную оценку обогащения на оси x из анализа обогащения набора генов KEGG генов ответа P4 (DEG сравнивают активацию в присутствии P4 по сравнению с активацией отдельно) на 6 и 24 часовВсе пути имеют скорректированное значение p FDR <0,05. (C, D) Диаграммы Венна перекрывающихся DEG между генами с повышенной и пониженной регуляцией в Т-клетках, активированных в присутствии или в отсутствие 50 мкМ P4. n = 3 неактивировано, n = 8 активировано с 50 мкМ P4 и без него. ДЭГ, дифференциально экспрессируемые гены: OR — отношение шансов; P4, прогестерон.

Демпфирующий эффект прогестерона на экспрессию генов CD4

+ Т-клеток очевиден также на уровне секретируемого белка

Чтобы выяснить, влияет ли P4 на протеомный уровень, мы провели скрининг 92 белков, связанных с воспалением. в культуральных супернатантах, собранных через 6, 24 и 72 часа, с использованием анализа расширения близости с высокой чувствительностью и специфичностью (47).Через 6 часов были обнаружены только 24 из 92 белков, из которых 14 (58%) белков по-разному экспрессировались между CD4 + Т-клетками, культивировавшимися в присутствии по сравнению с в отсутствие P4 (Рисунок 3A и Таблица S2. ). Через 24 часа 39 из 92 белков были обнаружены, и 28 (72%) из них были дифференциально экспрессированы, а через 72 часа было обнаружено 65 белков, но только 23 (35%) экспрессировались дифференциально (Рисунок 3A и Таблица S2). В соответствии с транскриптомными данными, большинство DEP были значительно ниже в супернатантах, собранных из Т-клеток, которые были активированы в присутствии P4, по сравнению с активацией отдельно.Только три белка (ADA, CXCL5 и EIF4EBP1) были активированы через 24 и / или 72 часа. Также на уровне белка P4, по-видимому, противодействовал изменениям, индуцированным во время активации, когда большинство белков, которые значительно усиливались во время активации Т-клеток (по сравнению с неактивированными клетками), подавлялись с помощью P4 (рисунки 3B-D), за исключением ADA (24 и 72). ч), CCL8 (72 часа), CXCL5 (24 часа), EIF4EBP1 (24 часа), интерлейкин (IL) -6 (72 часа) и TNFSF12 (24 часа). Было пять белков, которые постоянно подавлялись во всех трех временных точках: CXCL8, CCL8, IL-17A, фактор некроза опухоли (TNF) и FLT3LG (рис. 3E).Таким образом, подавляющий эффект P4 на связанные с иммунной системой процессы на транскриптомных уровнях дополнительно подтверждается его очевидным подавляющим действием на белки, связанные с воспалением.

Рис. 3 P4 значительно подавляет экспрессию белка в супернатантах культур. Панель белков, связанных с воспалением, измеряли в супернатантах, собранных из CD4 + Т-клеток, которые были культивированы неактивированными или активированными с использованием или без 50 мкМ P4 (n = 9 в течение 6 часов, n = 10 в течение 24 часов и n = 10 в течение 72 часов). (A) Volcano графики дифференциально экспрессируемых белков (DEP) через 6, 24 и 72 часа, сравнивающие активацию в присутствии или в отсутствие P4. DEP определяли с помощью теста Фридмана и Бенджамини-Хохберга. Данные представлены как разница в нормированных значениях экспрессии белка (NPX), предоставленных производителем. Синие точки DEP регулируются с понижением P4, красные точки активизируют DEP и серые точки FDR ≤ 0,05. (B – D) Тепловые карты дифференциально экспрессируемых белков, сравнивающие активацию в присутствии P4 и только активацию.ns представляют собой белки, которые существенно не различались между активацией и неактивированными. Медианные значения NPX показаны на рисунке. нс, незначительно. (E) Диаграмма Венна, показывающая количество уникальных и общих DEP в разные моменты времени.

Прогестерон значительно подавляет гены, связанные с иммуноопосредованными заболеваниями, которые модулируются во время беременности

Тот факт, что уровни P4 во время беременности совпадают с клиническими изменениями, наблюдаемыми при нескольких иммуноопосредованных заболеваниях, побудил нас исследовать, могут ли гены, на которые влияет P4, и.е. генов ответа P4 были связаны с установленными генами, связанными с заболеванием. С этой целью мы использовали связанные с заболеванием гены, полученные из DisGeNET (48), для семи заболеваний, которые, как было показано ранее, изменяются во время беременности (51): болезнь Хашимото, болезнь Грейвса, рассеянный склероз, псориаз, РА, системная красная волчанка ( СКВ) и системный склероз. Мы объединили гены ответа P4 как через 6, так и через 24 часа, в результате получили в общей сложности 2563 гена с пониженной регуляцией и 2403 гена с повышенной регуляцией, которые дифференциально экспрессировались P4 в течение 24 часов.В соответствии с предыдущим открытием гораздо более выраженного подавляющего действия P4 на гены, связанные с иммунитетом, гены ответа P4 с подавленной реакцией были значительно обогащены генами, связанными со всеми семью заболеваниями; Болезнь Хашимото (n = 51, OR: 2,6, p = 1,6×10 -7 ), болезнь Грейвса (n = 73, OR: 2,0, p = 2,3×10 -6 ), псориаз (n = 134, OR : 1,4, p = 5,8×10 -4 ), MS (n = 201, OR: 1,6, p = 7,0×10 -8 ), RA (n = 270, OR: 1,3, p = 6,8×10 -4 ), СКВ (n = 212, ИЛИ: 1.7, p = 1,4×10 -9 ) и системный склероз (n = 96, OR: 1,5, p = 8,5×10 -4 ), тогда как гены ответа с повышенной регуляцией P4 не показали значительного обогащения каких-либо генов, связанных с заболеванием (рисунок 4A и Таблица S3). Таким образом, для последующего анализа рассматривались только гены ответа P4 с пониженной регуляцией. Всего было 17 общих генов между всеми семью заболеваниями, которые были значительно подавлены P4: BCL2 , CXCL10 , FAS , FOXP3 , ICAM1 , IL10 , IL17A IL17A , , IL1B , IL21 , IL22 , IL23R , IL2R , ISG20 , RBM45 , TGFB1 и TNF (рис. патогенез заболевания.

Рис. 4 Прогестерон подавляет гены, связанные с заболеванием, для некоторых аутоиммунных заболеваний, в частности, через STAT1 и STAT3. Влияние P4 на гены, связанные с заболеванием, и вышестоящие факторы транскрипции исследовали с использованием известных генов болезни (полученных из DisGeNET), а взаимодействия TF-мишени были основаны на TRRUST и DoRothEA. (A) Обогащение связанных с заболеванием генов семи аутоиммунных заболеваний среди дифференциально экспрессируемых генов с помощью P4.DEG с пониженной регулировкой = синие столбцы, DEG с повышенным уровнем = красные столбцы. ДЭГ определяли, сравнивая клетки, активированные в присутствии Р4, с активацией отдельно, и представляли общее количество уникально экспрессируемых генов через 6 и 24 часа вместе. Пунктирная линия показывает p = 0,05. Гены, которые являются общими для всех семи заболеваний среди генов, дифференциально подавляемых с помощью P4, показаны над полосами. Значения p обогащения рассчитывали с помощью точного критерия Фишера. ТФ с наибольшим количеством взаимодействующих генов среди ассоциированных с заболеванием генов с дифференцированной подавляемой регуляцией для (B) общих генов семи различных заболеваний (всего из 36 TF) и (C) общих генов между MS, RA и псориаз (всего из 57 ТФ). (D, E) Схематическое изображение STAT1 и STAT3 и их взаимодействующих генов. STAT1 и STAT3 значительно подавляются P4, как и их цели, изображенные на рисунке. ДЭГ, дифференциально экспрессируемые гены; РС; рассеянный склероз; Р4, прогестерон; РА, ревматоидный артрит; ТФ, фактор транскрипции.

Изменения, вызванные прогестероном в генах, связанных с заболеванием, обогащены мишенями для STAT1 и STAT3

Чтобы получить более полное представление о влиянии P4 на изменения, связанные с заболеванием, мы попытались определить вышестоящие регуляторы генов пораженных заболеваний.Используя известные подтвержденные взаимодействия TF-мишени, сочетающие TRRUST (49) и DoRothEA (50), мы определили, что в общей сложности 36 TF были значительно затронуты P4 и вместе регулировали 12 из 17 общих генов болезни. STAT1 и STAT3 значительно подавлялись P4 и имели наибольшее количество генов-мишеней. Кроме того, мишени STAT1 и STAT3 были значительно обогащены среди генов болезни (STAT1: n = 9, OR: 9,5, p = 0,0004; STAT3: n = 7, OR: 11,8, p = 0,0001) (рисунок 4B и таблица S4). ). Затем мы сосредоточились на РС, РА и псориазе, которые, как было показано, заметно улучшаются во время беременности (52–54), чтобы более конкретно определить, на какие TF и ​​гены влияет P4.Всего было 62 общих гена между тремя заболеваниями, которые были значительно подавлены P4 (Таблица S5). В общей сложности 57 различных ТФ были аннотированы для регулирования 39 из этих общих генов (2,6 среднего числа взаимодействий на ТФ), где снова мишени для STAT1 и STAT3 были значительно обогащены среди общих генов, связанных с заболеванием (STAT1: n = 19, целевые 48 % общих генов, OR: 3,2, p = 0,001; STAT3: n = 14, нацелено на 36% общих генов, OR: 5,6, p = 3,0×10 -5 ) (рисунки 4C – E и таблица S5) .Таким образом, подавляющий эффект P4 на гены, ассоциированные с заболеванием, по-видимому, в первую очередь опосредуется нацеливанием на STAT1 и STAT3 и их нижестоящие мишени.

Связанные с заболеванием транскриптомные изменения, вызванные прогестероном, отражаются на уровне протеомики

Чтобы еще больше подчеркнуть роль P4 в связанном с беременностью улучшении MS, RA и псориаза, мы исследовали, отражаются ли связанные с заболеванием транскриптомные изменения на уровне белка. Таким образом, мы идентифицировали белки, в которых известные взаимодействующие TF, согласно TRRUST и DoRothEA, также были значительно затронуты P4, а ген, связанный с заболеванием, а также соответствующий белок были значительно подавлены P4.Мы объединили все белки, которые были значительно подавлены P4 через 6, 24 и 72 часа, чтобы получить глобальную карту протеомных изменений, в результате чего получился 41 DEP. Сосредоточившись на STAT1 и STAT3, мы обнаружили, что несколько связанных с заболеванием белков ниже STAT1 и STAT3 значительно снижены на P4: IL-12β (STAT1), IL-10 (STAT1, STAT3), IL-2 (STAT3), CXCL10 ( STAT1), OSM (STAT3) и TGF-β1 (STAT3) (Таблица 1). Кроме того, мы обнаружили три дополнительных белка, которые также были связаны с заболеванием, соответствующие гены которых были значительно подавлены P4: TNF, TNFSF10 и IL-13 (Таблица 1).Таким образом, для девяти белков, связанных с воспалением, мы можем подтвердить, что транскриптомные изменения, индуцированные P4, также отражались на протеомных уровнях. Взятые вместе, P4 значительно влияет на экспрессию TF, приводя к подавлению взаимодействующих генов, связанных с заболеванием, что, в свою очередь, снижает экспрессию соответствующих белков.

Таблица 1 Гены и белки, ассоциированные с заболеванием, и соответствующие им факторы транскрипции, на которые значительно влияет P4.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы демонстрируем, что P4 значительно подавляет активацию Т-клеток, что дает убедительное объяснение того, как ответы Т-клеток потенциально могут регулироваться во время беременности, когда уровни P4 высоки и требуется иммунная регуляция. Транскриптомный анализ показал, что P4 значительно изменяет профиль экспрессии генов, подавляя связанные с иммунитетом гены и пути, такие как JAK-STAT и передачу сигналов Т-клеточного рецептора. Интересно, что транскриптомные изменения, индуцированные P4, были сильно обогащены генами, связанными с иммуноопосредованными заболеваниями, которые, как известно, модулируются во время беременности, такие как MS, RA, псориаз и SLE.Кроме того, STAT1 и STAT3 были выделены как центральные регуляторы, и несколько нижестоящих мишеней были значительно подавлены P4, также на уровне белка, включая несколько хорошо известных и значимых для болезни цитокинов. Наши результаты расширяют предыдущие знания о P4 как иммунорегуляторном гормоне и предоставляют дополнительные знания о том, как P4 влияет на активацию Т-клеток CD4 + и его потенциальное участие в модуляции связанного с беременностью заболевания, наблюдаемого при нескольких иммуноопосредованных заболеваниях.В совокупности наши результаты подтверждают роль P4 как иммуносупрессивного гормона и указывают на то, что P4 играет важную роль в иммуномодулирующих реакциях, вызванных беременностью. Наши результаты открывают путь к исследованию новых терапевтических режимов, имитирующих ситуацию беременности, при иммуноопосредованных заболеваниях.

Предыдущие исследования изучали влияние P4 на активацию лимфоцитов и CD3 + Т-клеток (35, 55–58), и наши результаты согласуются с подавляющим эффектом P4 на иммунные ответы.Однако, насколько нам известно, настоящее исследование является не только первым исследованием, направленным на прямую оценку влияния P4 на активацию Т-клеток CD4 + человека, но и первым исследованием, в котором выполнено углубленное транскриптомное профилирование для расшифровки эффектов P4. Используя систему активации Т-клеток in vitro , было обнаружено, что P4 последовательно ингибирует активацию Т-клеток, что очевидно из снижения экспрессии маркеров активации клеточной поверхности и глубокого подавления иммунных генов и белков.Кроме того, изменениям, которые были специфически связаны с фактической активацией Т-клеток, действительно противодействовал P4, , то есть генов и белков, активированных во время активации Т-клеток, подавлялись P4 и , наоборот, . Активация Т-клеток действительно является важной контрольной точкой для иммунной регуляции как толерантности к беременности (59), так и аутоиммунитета (33, 60), и было показано, что введение Р4 предотвращает вызванные активацией Т-клеток преждевременные роды и преждевременные роды на животной модели (61 ), подчеркивая важность P4 в контроле активации Т-клеток во время беременности.

P4 был предложен в качестве одного потенциального кандидата для индуцированной беременностью иммунной модуляции нескольких аутоиммунных заболеваний, учитывая корреляцию уровней P4 с активностью заболевания во время беременности. Действительно, предварительное лечение P4 при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (EAE) на животной модели рассеянного склероза ослабляло тяжесть заболевания и уменьшало воспалительные реакции (62, 63). Кроме того, даже после начала EAE введение P4 могло значительно снизить тяжесть заболевания (64). Наши данные о том, что индуцированные P4 гены были значительно обогащены генами, связанными с заболеванием, относящимися к нескольким аутоиммунным заболеваниям, которые, как известно, модулируются во время беременности, обеспечивают дополнительную поддержку возможного участия P4 в активности, модулирующей это заболевание.Интересно, что при всех заболеваниях было несколько перекрывающихся генов, что указывает на потенциально общие механизмы модуляции, вызванной беременностью. Действительно, трудно предположить, какие концентрации P4 будут иметь отношение к иммуномодуляции, вызванной беременностью. Мы использовали концентрации P4, аналогичные или более высокие, чем в плаценте (65), с наиболее выраженным демпфирующим эффектом при самой высокой концентрации. Релевантность выбранных концентраций для модуляции заболевания, вызванного беременностью, может быть оспорена с учетом более низких системных концентраций P4 (66).Однако экстраполяция уровней in vivo на in vitro остается проблематичной. In vivo , есть несколько других факторов и вовлеченных клеток, которые потенциально могут усиливать гормональные эффекты. Действительно, локальные межклеточные концентрации могут быть выше, чем измеряемые в настоящее время уровни, что может объяснить, почему наиболее часто используются супрафизиологические концентрации in vitro. Кроме того, циркулирующие материнские иммунные клетки секвестрируются в плаценте, где они вступают в тесный контакт с производящими гормоны клетками плода (67) и, таким образом, потенциально могут подвергаться воздействию гораздо более высоких уровней P4, чем в периферическом кровообращении.

STAT1 и STAT3, которые, как было обнаружено, значительно подавляются P4, вовлечены в патогенез некоторых аутоиммунных заболеваний. Например, было показано, что потеря экспрессии STAT3 в Т-клетках обеспечивает защиту от EAE (68), а высокие уровни STAT3 можно использовать для прогнозирования конверсии клинически изолированного синдрома в определенный MS (69). Более того, нацеливание на STAT3 было предложено в качестве потенциального терапевтического подхода при таких заболеваниях, как MS, псориаз и RA (70–72).STAT1 и STAT3 являются центральными TF в управлении дифференцировкой клеток T H 1 и T H 17. Ранее было показано, что P4 подавляет иммунные ответы, связанные как с T H 1, так и с T H 17 (20, 73–76), и предполагается, что он играет важную роль в переходе от T H 1 / T H 17 в пользу большего количества ответов T H 2 / T reg во время беременности (19). Предполагается, что подавляющий эффект P4 на STAT1 и STAT3 может быть вовлечен в изменение баланса T H 1 и T H 17, иммунных ответов, которые являются важной частью патогенеза болезни при РС, псориазе и РА, которые может быть возможным механизмом модуляции активности заболевания, вызванной беременностью.Наши транскриптомные результаты были дополнительно подтверждены на уровне белка для нескольких очень важных мишеней заболевания, расположенных ниже STAT1 и STAT3. Нацеливание на IL-12β (IL12p40), который представляет собой перекресток между T H 1-ассоциированным IL-12 и T H 17-связанным IL-23, успешно применяется для лечения псориаза и проходит клинические испытания для нескольких других иммуноопосредованные воспалительные заболевания (77). Ясно, что IL-12β играет важную роль в заболевании, и подавляющий эффект P4 на этот ген и последующая экспрессия белка могут, таким образом, составлять возможный путь в модуляции болезни с помощью P4.Примечательно, что P4 не только подавлял провоспалительные, но и противовоспалительные гены и белки, такие как IL-10 и TGF-β, что указывает на то, что P4 вызывает довольно общее подавление иммунных ответов. Хорошо известно, что противовоспалительные реакции часто индуцируются как механизм отрицательной обратной связи во время воспаления, чтобы помочь предотвратить чрезмерные воспалительные реакции и помочь восстановить гомеостаз тканей. Предположительно, поскольку P4 ослабляет иммунные ответы, естественно предположить, что в результате последуют меньшие противовоспалительные реакции.Это иллюстрируется сложной взаимосвязью между STAT3 и IL-10, где промотор IL10 содержит специфический мотив связывания для STAT3, который, по-видимому, контролирует экспрессию IL10 (78). Действительно, повышенная экспрессия STAT3 в Т-клетках пациентов с СКВ способствовала экспрессии IL-10 (79), и аналогичные ассоциации были предложены также между STAT3 и TGF-β (80, 81).

Одним из потенциальных ограничений нашего исследования является то, что мы исследовали эффект P4 у здоровых женщин-доноров.Насколько нам известно, нет исследований, которые бы специально оценивали, будут ли пациенты с аутоиммунными заболеваниями иначе реагировать на P4, чем здоровые люди. Кроме того, реакция на P4 может варьироваться, поскольку экспрессия рецепторов, связанных с P4, может варьироваться на протяжении менструального цикла (82, 83). Женщины, включенные в это исследование, были отобраны равномерно в течение менструального цикла, что должно минимизировать систематическую ошибку в различиях экспрессии рецепторов. Кроме того, клетки всех включенных женщин последовательно реагировали на P4.Кроме того, в качестве потенциального варианта лечения необходимо дополнительно изучить влияние P4 на мужчин. Действительно, введение P4 показало широко распространенные физиологические эффекты у мужчин (84), хотя подробные исследования воздействия на мужскую иммунную систему отсутствуют. Интересно, что обнадеживающие результаты были отмечены в недавнем пилотном клиническом исследовании, в котором прогестерон использовался у пациентов мужского пола с COVID-19 с целью смягчить гиперактивную иммунную систему, а иногда и фатальный цитокиновый шторм.Примечательно, что не сообщалось о серьезных побочных эффектах, связанных с прогестероном, даже при уровнях прогестерона, подобных тем, которые были обнаружены во время беременности (85). Хотя необходимы дальнейшие исследования, исследование подчеркивает потенциал использования прогестерона для лечения мужчин.

Еще одно предупреждение, которое еще не решено, — это точные механизмы, с помощью которых работает P4. Расшифровка рецепторов, которые участвуют в опосредовании эффектов P4, довольно сложна из-за беспорядочной природы P4, потенциально связывающей как мембранные, так и ядерные рецепторы прогестерона (PR), а также рецепторы глюкокортикоидов и минералокортикоидов.В отличие от мышей, в большинстве исследований на людях не удалось обнаружить экспрессию ядерного PR в лимфоцитах (24, 86). Также, по нашим данным, ядерного пиара не было. Вместо этого была обнаружена экспрессия мембранных PR PGRMC1, PGRMC2, PAQR6 и PAQR7, что, скорее всего, исключает любое возможное участие ядерного PR. Об экспрессии и передаче сигналов через мембранные PR сообщалось в человеческих Т-клетках (58, 86, 87), что согласуется с наблюдаемыми здесь эффектами. Однако нельзя исключить участие глюкокортикоидного рецептора (88, 89), и было показано, что синтетический кортикостероид дексаметазон оказывает такое же влияние на дифференцировку Т-клеток, что и P4 (76).Скорее всего, наблюдаемый эффект P4 представляет собой комбинаторный эффект, опосредованный через различных рецепторов. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы проанализировать участие и важность различных рецепторов в передаче сигналов P4, например, посредством блокирования действия различных рецепторов. Недавно описанный специфический антагонист глюкокортикоидов (CORT125134) без связывания PR (90) в сочетании с синтетическими прогестинами с различным сродством к различным рецепторам может улучшить понимание вклада глюкокортикоидного рецептора по сравнению с PR.

Таким образом, мы показали, что присутствие P4 значительно снижает активацию Т-клеток CD4 + и индуцирует большие транскриптомные изменения в активированных клетках. Наиболее заметно подавляемые P4 иммунные ответы, связанные с активацией Т-клеток, и гены, на которые воздействует P4, были значительно обогащены связанными с заболеванием генами иммуноопосредованных заболеваний, которые, как известно, модулируются во время беременности. Мы пришли к выводу, что наше исследование подтверждает роль P4 в иммуномодуляции, индуцированной во время беременности, и что P4 следует дополнительно оценивать как потенциальный вариант лечения при заболеваниях, опосредованных Т-клетками.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, представленные в этом исследовании, можно найти в онлайн-репозиториях. Названия репозитория / репозиториев и номера доступа можно найти ниже: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, GSE162051.

Заявление об этике

Исследования с участием людей были рассмотрены и одобрены Региональным советом по этике в Линчёпинге (Regionala etikprövningsnämnden i Linköping), Швеция (номер одобрения: M39-08). Участники предоставили письменное информированное согласие на участие в этом исследовании.

Вклад авторов

SH, JR и GP собрали образцы и провели эксперименты на культуре клеток и проточную цитометрию. SH, OR и RM выполнили предварительную обработку, анализ данных секвенирования РНК и биоинформатический анализ. JE, MG и MJ внесли свой вклад в дизайн исследования и общее руководство исследованием. SH отвечал за подготовку рисунков и написание рукописи при поддержке MG, JE и MJ. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Это исследование финансировалось Шведским фондом стратегических исследований (SB16-0011), Шведским исследовательским советом (2018-02776), Шведским фондом исследований РС, NEURO Sweden, Шведским медицинским обществом (SLS-879791) ) и исследовательские фонды Шведского фонда львов.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Выражение признательности

Авторы выражают признательность Национальной инфраструктуре геномики (NGI) в Стокгольме, финансируемой лабораторией Science for Life, Фондом Кнута и Алисы Валленберг, Шведским исследовательским советом и Многопрофильным центром передовых вычислительных наук SNIC / Упсалы за помощь в массовое параллельное упорядочение и доступ к вычислительной инфраструктуре UPPMAX. Авторы также хотели бы поблагодарить Центр клинических биомаркеров SciLifeLab в Швеции за помощь в анализе белков.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2021.672168/full#supplementary-material

Ссылки

3. Labarta E , Мариани Г., Хольтманн Н., Селада П., Ремохи Дж., Бош Э. Низкий уровень прогестерона в сыворотке в день переноса эмбриона связан со снижением продолжающейся беременности в циклах донорства ооцитов после подготовки искусственного эндометрия: перспективное исследование. Hum Reprod (2017) 32: 2437–42. doi: 10.1093 / humrep / dex316

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Lydon JP, DeMayo FJ, Funk CR, Mani SK, Hughes AR, Montgomery CA Jr, et al. Мыши, лишенные рецептора прогестерона, демонстрируют плейотропные репродуктивные аномалии. Genes Dev (1995) 9: 2266–78. doi: 10.1101 / gad.9.18.2266

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Ку Ч.В., Аллен Дж.С. младший, Лек С.М., Чиа М.Л., Тан Н.С., Тан Т.С.Распределение прогестерона в сыворотке при нормальной беременности по сравнению с беременностями, осложненными угрозой выкидыша на сроке от 5 до 13 недель беременности: проспективное когортное исследование. BMC Беременность и роды (2018) 18: 360. doi: 10.1186 / s12884-018-2002-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Окабе Х, Макино С., Като К., Мацуока К., Секи Х., Такеда С. Влияние прогестерона на гены, участвующие в преждевременных родах. J Reprod Immunol (2014) 104-105: 80–91.DOI: 10.1016 / j.jri.2014.03.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Arck PC, Rucke M, Rose M, Szekeres-Bartho J, Douglas AJ, Pritsch M, et al. Факторы раннего риска выкидыша: проспективное когортное исследование беременных женщин. Репродукция BioMed Online (2008) 17: 101–13. doi: 10.1016 / S1472-6483 (10) 60300-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Couzinet B, Le Strat N, Ulmann A, Baulieu EE, Schaison G.Прерывание ранней беременности антагонистом прогестерона RU 486 (мифепристон). N Engl J Med (1986) 315: 1565–70. doi: 10.1056 / NEJM198612183152501

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Джарде А., Луцив О., Бейене Дж., Макдональд С.Д. Вагинальный прогестерон, пероральный прогестерон, 17-OHPC, Cerclage и пессарий для предотвращения преждевременных родов при одноплодной беременности с повышенным риском: обновленный систематический обзор и сетевой мета-анализ. BJOG (2019) 126: 556–67.doi: 10.1111 / 1471-0528.15566

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Confavreux C, Hutchinson M, Hours MM, Cortinovis-Tourniaire P, Moreau T. Частота рецидивов рассеянного склероза, связанных с беременностью. Беременность в группе рассеянного склероза. N Engl J Med (1998) 339: 285–91. doi: 10.1056 / NEJM1998073033

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Бойд А.С., Моррис Л.Ф., Филлипс К.М., Ментер Массачусетс. Псориаз и беременность: взаимодействие гормонов и иммунной системы. Int J Dermatol (1996) 35: 169–72. doi: 10.1111 / j.1365-4362.1996.tb01632.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Досиоу К., Лати Р. Б., Тулак С., Хуанг С. Т., Джудиче Л. С.. Связанные с интерфероном и другие иммунные гены подавляются в лейкоцитах периферической крови в лютеиновой фазе менструального цикла. J Clin Endocrinol Metab (2004) 89: 2501–4. doi: 10.1210 / jc.2003-031647

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16.Kalo-Klein A, Witkin SS. Регуляция иммунного ответа на Candida Albicans моноцитами и прогестероном. Am J Obstet Gynecol (1991) 164: 1351–4. doi: 10.1016 / 0002-9378 (91)

-Z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Мохаммад И., Старская И., Надь Т., Го Дж., Яткин Э., Ваананен К. и др. Альфа-рецептор эстрогена способствует опосредованному Т-клетками аутоиммунному воспалению, способствуя активации и пролиферации Т-клеток. Sci Signal (2018) 11: eaap9415.doi: 10.1126 / scisignal.aap9415

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Пиччинни М.П., ​​Джудизи М.Г., Бьяджиотти Р., Белони Л., Джаннарини Л., Сампоньяро С. и др. Прогестерон способствует развитию Т-хелперных клеток человека, продуцирующих цитокины Th3-типа, и способствует как продукции IL-4, так и мембранной экспрессии CD30 в установленных клонах клеток Th2. J Immunol (1995) 155: 128–33.

PubMed Аннотация | Google Scholar

21. Яо Й, Ли Х, Дин Дж, Ся Й, Ван Л.Прогестерон нарушает антиген-неспецифическую иммунную защиту CD8 Т-клеток памяти посредством гиперметилирования гена интерферона-гамма. PloS Pathog (2017) 13: e1006736. doi: 10.1371 / journal.ppat.1006736

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Su L, Sun Y, Ma F, Lu P, Huang H, Zhou J. Прогестерон ингибирует врожденный иммунный ответ, опосредованный Toll-подобным рецептором 4, в макрофагах, подавляя активацию NF-kappaB и усиливая экспрессию SOCS1. Immunol Lett (2009) 125: 151–5.doi: 10.1016 / j.imlet.2009.07.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Ли Дж. Х., Лайдон Дж. П., Ким Ч. Прогестерон подавляет путь mTOR и способствует образованию индуцированных регуляторных Т-клеток с повышенной стабильностью. Eur J Immunol (2012) 42: 2683–96. doi: 10.1002 / eji.201142317

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Лиссауэр Д., Элдершоу С.А., Инман С.Ф., Кумарасами А., Мосс, Пенсильвания, Килби, Мэриленд. Прогестерон способствует толерантности матери и плода за счет снижения полифункциональности материнских Т-клеток человека и индукции специфического цитокинового профиля. Eur J Immunol (2015) 45: 2858–72. doi: 10.1002 / eji.201445404

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Павия С., Ситери П.К., Перлман Д.Д., Стайтс Д.П. Подавление взаимодействий аллогенных клеток мышей половыми гормонами. J Reprod Immunol (1979) 1: 33–8. doi: 10.1016 / 0165-0378 (79) -5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Fekecs T, Kalmar-Nagy K, Szakaly P, Nemeth K, Moezzi M, Zapf I, et al.Изменение фактора блокировки прогестерона у пациентов после трансплантации почки. Transplant Proc (2011) 43: 3694–6. doi: 10.1016 / j.transproceed.2011.08.087

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Мьёсберг Дж., Берг Дж., Дженмальм М.К., Эрнеруд Дж. Регуляторные Т-клетки FOXP3 + и Т-хелперы 1, Т-хелперы 2 и Т-хелперы 17 в децидуальной ранней беременности человека. Биол Репрод (2010) 82: 698–705. doi: 10.1095 / biolreprod.109.081208

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32.Тилбург Т., Ролен Д.Л., ван дер Маст Б.Дж., де Гроот-Свингс Г.М., Клейбург С., Шерджон С.А. и др. Доказательства избирательной миграции плода-специфичных CD4 + CD25bright регуляторных Т-клеток из периферической крови в децидуальную оболочку при беременности человека. J Immunol (2008) 180: 5737–45. doi: 10.4049 / jimmunol.180.8.5737

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Хьюз Г.С., Кларк Е.А., Вонг А.Х. Внутриклеточный рецептор прогестерона регулирует CD4 + Т-клетки и Т-клеточно-зависимые ответы антител. J Leukoc Biol (2013) 93: 369–75. doi: 10.1189 / jlb.1012491

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Chien EJ, Chang CP, Lee WF, Su TH, Wu CH. Негеномные иммуносупрессивные действия прогестерона ингибируют PHA-индуцированное подщелачивание и активацию Т-клеток. J Cell Biochem (2006) 99: 292–304. doi: 10.1002 / jcb.20858

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Chien EJ, Liao CF, Chang CP, Pu HF, Lu LM, Shie MC, et al.Негеномные эффекты на Na + / H + -обмен 1 прогестероном и 20альфа-гидроксипрогестероном в Т-клетках человека. J Cell Physiol (2007) 211: 544–50. doi: 10.1002 / jcp.20962

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Добин А., Дэвис К.А., Шлезингер Ф., Дренков Дж., Залески С., Джа С. и др. STAR: сверхбыстрый универсальный выравниватель последовательности РНК. Биоинформатика (2013) 29: 15–21. doi: 10.1093 / биоинформатика / bts635

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38.Pertea M, Pertea GM, Antonescu CM, Chang TC, Mendell JT, Salzberg SL. StringTie обеспечивает улучшенную реконструкцию транскриптома на основе считывания последовательности РНК. Nat Biotechnol (2015) 33: 290–5. doi: 10.1038 / nbt.3122

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Робинсон, доктор медицины, Маккарти, ди-джей, Смит, Г.К. edgeR: Пакет биопроводников для анализа дифференциальной экспрессии цифровых данных экспрессии генов. Биоинформатика (2010) 26: 139–40. doi: 10.1093 / биоинформатика / btp616

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40.McCarthy DJ, Chen Y, Smyth GK. Анализ дифференциальной экспрессии многофакторных экспериментов с РНК-Seq в отношении биологического разнообразия. Nucleic Acids Res (2012) 40: 4288–97. doi: 10.1093 / nar / gks042

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Ричи М.Э., Фипсон Б., Ву Д., Ху Й., Лоу К.В., Ши В. и др. Лимма Пауэрс Дифференциальный анализ экспрессии для секвенирования РНК и исследований микрочипов. Nucleic Acids Res (2015) 43: e47. doi: 10.1093 / nar / gkv007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42.Law CW, Alhamdoosh M, Su S, Dong X, Tian L, Smyth GK и др. Анализ РНК-Seq прост как 1-2-3 с помощью Limma, Glimma и Edger. F1000Res (2016) 5: 1408. doi: 10.12688 / f1000research.9005.2

CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Assarsson E, Lundberg M, Holmquist G, Bjorkesten J, Thorsen SB, Ekman D, et al. Гомогенный иммуноферментный анализ 96-Plex PEA, демонстрирующий высокую чувствительность, специфичность и отличную масштабируемость. PloS One (2014) 9: e95192. DOI: 10,1371 / журнал.pone.0095192

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Пинеро Дж., Рамирес-Ангита Дж. М., Сух-Питарх Дж., Ронзано Ф., Сентено Э., Санс Ф. и др. Платформа знаний DisGeNET для геномики болезней: обновление 2019 г. Nucleic Acids Res (2020) 48: D845 – D55. doi: 10.1093 / nar / gkz1021

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Хан Х, Чо Дж. У., Ли С., Юн А., Ким Х, Бэ Д. и др. TRRUST v2: Расширенная справочная база данных о регуляторных взаимодействиях транскрипции человека и мыши. Nucleic Acids Res (2018) 46: D380 – D6. doi: 10.1093 / nar / gkx1013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Гарсия-Алонсо Л., Холланд С.Х., Ибрагим М.М., Турей Д., Саез-Родригес Дж. Сравнительный анализ и интеграция ресурсов для оценки активности факторов транскрипции человека. Genome Res (2019) 29: 1363–75. doi: 10.1101 / gr.240663.118

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Piccinni MP, Lombardelli L, Logiodice F, Kullolli O, Parronchi P, Romagnani S.Как беременность может повлиять на прогрессирование аутоиммунных заболеваний? Clin Mol Allergy (2016) 14:11. doi: 10.1186 / s12948-016-0048-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53. Finkelsztejn A, Brooks JB, Paschoal FM Jr, Fragoso YD. Что мы действительно можем сказать женщинам с рассеянным склерозом о беременности? Систематический обзор и метаанализ литературы. BJOG (2011) 118: 790–7. doi: 10.1111 / j.1471-0528.2011.02931.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54.де Ман Я. А., Долхайн Р. Дж., ван де Гейн Ф. Е., Виллемсен С. П., Хейз Дж. М.. Активность заболевания ревматоидным артритом во время беременности: результаты общенационального проспективного исследования. Arthritis Rheum (2008) 59: 1241–8. doi: 10.1002 / art.24003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

55. Клеменс Л.Е., Ситери П.К., Стайтс Д.П. Механизм иммуносупрессии прогестерона при активации материнских лимфоцитов во время беременности. J Immunol (1979) 122: 1978–85.

PubMed Аннотация | Google Scholar

56. Эринг Г. Р., Кершбаум Х. Х., Эдер С., Небен А. Л., Фангер С. М., Хури Р. М. и др. Негеномный механизм опосредованной прогестероном иммуносупрессии: ингибирование каналов K +, передачи сигналов Ca2 + и экспрессии генов в Т-лимфоцитах. J Exp Med (1998) 188: 1593–602. doi: 10.1084 / jem.188.9.1593

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

57. Кобаяши Х., Мори Т., Сузуки А., Нисимура Т., Нишимото Х., Харада М.Подавление смешанной реакции лимфоцитов прогестероном и эстрадиолом-17бета. Am J Obstet Gynecol (1979) 134: 255–9. DOI: 10.1016 / S0002-9378 (16) 33029-0

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

58. Ndiaye K, Poole DH, Walusimbi S, Cannon MJ, Toyokawa K, Maalouf SW, et al. Действие прогестерона на лимфоциты может быть опосредовано мембранными рецепторами прогестерона. J Reprod Immunol (2012) 95: 15–26. doi: 10.1016 / j.jri.2012.04.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

60.Hellberg S, Eklund D, Gawel DR, Köpsén M, Zhang H, Nestor CE и др. Гены динамического ответа в CD4 + Т-клетках обнаруживают сеть взаимодействующих белков, которая классифицирует активность заболевания при рассеянном склерозе. Cell Rep (2016) 16: 2928–39. doi: 10.1016 / j.celrep.2016.08.036

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

61. Arenas-Hernandez M, Romero R, Xu Y, Panaitescu B, Garcia-Flores V, Miller D, et al. Эффекторные и активированные Т-клетки вызывают преждевременные роды и роды, которые предотвращаются лечением прогестероном. Дж. Иммунол (2019) 202: 2585–608. doi: 10.4049 / jimmunol.1801350

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

62. Garay L, Gonzalez Deniselle MC, Lima A, Roig P, De Nicola AF. Влияние прогестерона на спинной мозг модели рассеянного склероза у мышей. Дж. Стероид Биохим. Мол Биол (2007) 107: 228–37. doi: 10.1016 / j.jsbmb.2007.03.040

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

63. Garay L, Gonzalez Deniselle MC, Meyer M, Costa JJ, Lima A, Roig P, et al.Защитные эффекты введения прогестерона на аксональную патологию у мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом. Brain Res (2009) 1283: 177–85. doi: 10.1016 / j.brainres.2009.04.057

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

64. Yates MA, Li Y, Chlebeck P, Proctor T., Vandenbark AA, Offner H. Лечение прогестероном снижает тяжесть заболевания и увеличивает уровень IL-10 при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите. J Neuroimmunol (2010) 220: 136–9.doi: 10.1016 / j.jneuroim.2010.01.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

65. Файнштейн В., Бен-Цви З., Шейнер Э., Амаш А., Шейзаф Б., Холькберг Г. Уровни прогестерона при кесаревом сечении и плаценте при нормальных родах. Arch Gynecol Obstet (2010) 281: 387–92. doi: 10.1007 / s00404-009-1125-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

68. Лю Х, Ли Ю.С., Ю ЧР, Эгвуагу CE. Потеря STAT3 в CD4 + Т-клетках предотвращает развитие экспериментальных аутоиммунных заболеваний. J Immunol (2008) 180: 6070–6. doi: 10.4049 / jimmunol.180.9.6070

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

69. Фрисулло Дж., Носити В., Иорио Р., Патанелла А. К., Марти А., Мирабелла М. и др. Постоянство высоких уровней экспрессии pSTAT3 в циркулирующих CD4 + Т-клетках от пациентов с CIS способствует раннему превращению в клинически определяемый рассеянный склероз. J Neuroimmunol (2008) 205: 126–34. doi: 10.1016 / j.jneuroim.2008.09.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

70.Оике Т., Сато Й., Кобаяши Т., Миямото К., Накамура С., Канеко Ю. и др. Stat3 как потенциальная терапевтическая мишень при ревматоидном артрите. Sci Rep (2017) 7: 10965. doi: 10.1038 / s41598-017-11233-w

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

71. Миёси К., Такаиши М., Накадзима К., Икеда М., Канда Т., Тарутани М. и др. Stat3 как терапевтическая мишень для лечения псориаза: клиническое технико-экономическое исследование с использованием STA-21, ингибитора Stat3. J Invest Dermatol (2011) 131: 108–17.doi: 10.1038 / jid.2010.255

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

72. Лю Й., Холдбрукс А.Т., Де Сарно П., Роуз А.Л., Янагисава Л.Л., МакФарланд BC и др. Терапевтическая эффективность подавления пути Jak / STAT в нескольких моделях экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита. J Immunol (2014) 192: 59–72. doi: 10.4049 / jimmunol.1301513

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

73. Xu L, Dong B, Wang H, Zeng Z, Liu W, Chen N, et al.Прогестерон подавляет ответы клеток Th27 и усиливает развитие регуляторных Т-клеток посредством тимических стромальных лимфопоэтин-зависимых механизмов при экспериментальной гонококковой инфекции половых путей. Микробы заражают (2013) 15: 796–805. doi: 10.1016 / j.micinf.2013.06.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

74. Ли Дж. Х., Ульрих Б., Чо Дж., Пак Дж., Ким Ч. Прогестерон способствует дифференцировке Т-клеток пуповинной крови плода человека в Т-регуляторные клетки, но подавляет их дифференцировку в клетки Th27. J Immunol (2011) 187: 1778–87. doi: 10.4049 / jimmunol.1003919

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

75. Абдул Хусейн Г., Азизие Ф., Махсид М., Рагупати Р. Влияние прогестерона, дидрогестерона и эстрогена на выработку цитокинов Th2 / Th3 / Th27 лимфоцитами женщин с рецидивирующим самопроизвольным выкидышем. Дж Репрод Иммунол (2020) 140: 103132. DOI: 10.1016 / j.jri.2020.103132

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

77.Teng MW, Bowman EP, McElwee JJ, Smyth MJ, Casanova JL, Cooper AM и др. Цитокины IL-12 и IL-23: от открытия до целевой терапии иммуно-опосредованных воспалительных заболеваний. Нат Мед (2015) 21: 719–29. DOI: 10,1038 / нм.3895

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

78. Бенкхарт Е.М., Зидлар М., Ведель А., Вернер Т., Циглер-Хайтброк Х.В. Роль Stat3 в индуцированной липополисахаридом экспрессии гена IL-10. J Immunol (2000) 165: 1612–7.doi: 10.4049 / jimmunol.165.3.1612

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

79. Хедрих К.М., Рауэн Т., Апостолидис С.А., Грамматикос А.П., Родригес Родригес Н., Иоаннидис К. и др. Stat3 способствует экспрессии IL-10 в Т-клетках волчанки посредством трансактивации и ремоделирования хроматина. Proc Natl Acad Sci USA (2014) 111: 13457–62. doi: 10.1073 / pnas.1408023111

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

80. Ши Дж., Фэн Дж., Се Дж., Мэй З., Ши Т., Ван С. и др.Нацеленная блокада путей TGF-бета и IL-6 / JAK2 / STAT3 подавляет рост рака легких, стимулируемый миофибробластами костного мозга. Sci Rep (2017) 7: 8660. doi: 10.1038 / s41598-017-09020-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

81. Лю Р.Й., Цзэн Й., Лей З., Ван Л., Ян Х., Лю З. и др. Передача сигналов JAK / STAT3 необходима для индуцированного TGF-бета эпителиально-мезенхимального перехода в раковых клетках легких. Int J Oncol (2014) 44: 1643–51. DOI: 10.3892 / ijo.2014.2310

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

82. Mertens HJ, Heineman MJ, Theunissen PH, de Jong FH, Evers JL. Экспрессия рецепторов андрогенов, эстрогенов и прогестерона в матке человека во время менструального цикла. евро J Obstet Gynecol Reprod Biol (2001) 98: 58–65. DOI: 10.1016 / S0301-2115 (00) 00554-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

83. Mangal RK, Wiehle RD, Poindexter AN, 3, Weigel NL.Дифференциальная экспрессия маточных форм рецепторов прогестерона A и B во время менструального цикла. J Стероид Biochem Mol Biol (1997) 63: 195–202. doi: 10.1016 / S0960-0760 (97) 00119-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

85. Гандехари С., Матусов Ю., Пепковиц С., Штейн Д., Кадери Т., Нараянан Д. и др. Прогестерон в дополнение к стандарту лечения по сравнению со стандартом лечения в одиночку при лечении мужчин, госпитализированных с Covid-19 от умеренной до тяжелой степени: рандомизированное контролируемое пилотное исследование. Сундук (2021 г.). doi: 10.1016 / j.chest.2021.02.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

86. Dosiou C, Hamilton AE, Pang Y, Overgaard MT, Tulac S, Dong J, et al. Экспрессия мембранных рецепторов прогестерона на человеческих Т-лимфоцитах и ​​клетках Jurkat и активация G-белков прогестероном. J Endocrinol (2008) 196: 67–77. doi: 10.1677 / JOE-07-0317

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

87.Арейя А., Вале-Перейра С., Алвес В., Родригес-Сантос П., Моура П., Мота-Пинто А. Мембранные рецепторы прогестерона в регуляторных Т-клетках человека: реальность во время беременности. BJOG (2015) 122: 1544–50. doi: 10.1111 / 1471-0528.13294

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

88. Энглер Дж. Б., Курсаве Н., Солано М. Е., Патас К., Верманн С., Хекманн Н. и др. Глюкокортикоидный рецептор в Т-клетках обеспечивает защиту от аутоиммунитета во время беременности. Proc Natl Acad Sci USA (2017) 114: E181 – E90.doi: 10.1073 / pnas.1617115114

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

89. Hierweger AM, Engler JB, Friese MA, Reichardt HM, Lydon J, DeMayo F, et al. Прогестерон модулирует ответ Т-клеток посредством зависимых от глюкокортикоидных рецепторов путей. Am J Reprod Immunol (2019) 81: e13084. doi: 10.1111 / aji.13084

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

90. Hunt H, Donaldson K, Strem M, Zann V, Leung P, Sweet S и др.Оценка безопасности, переносимости, фармакокинетики и фармакологического эффекта перорально вводимого CORT125134: адаптивное, двойное слепое, рандомизированное, плацебо-контролируемое клиническое исследование фазы 1. Clin Pharmacol Drug Dev (2018) 7: 408–21. doi: 10.1002 / cpdd.389

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Прогестерон специфически подавляет связанные с заболеванием Th2- и Th27-связанные иммунные реакции во время активации Т-клеток in vitro

РЕЗЮМЕ

Изменения уровня прогестерона (P4) во время и после беременности совпадают с временным улучшением и ухудшением некоторых аутоиммунные заболевания, такие как рассеянный склероз (РС) и ревматоидный артрит (РА).Скорее всего, иммунно-эндокринные взаимодействия играют основную роль в этих эффектах, вызывающих беременность. В этом исследовании мы использовали секвенирование следующего поколения, чтобы изучить прямое влияние P4 на активацию Т-клеток CD4 + , имеющую центральное значение при беременности и заболеваниях. Мы обнаружили, что P4 оказывает сильное подавляющее действие на активацию Т-клеток, изменяя профиль экспрессии генов и белков и противодействуя многим изменениям, вызванным во время активации. Транскриптомные изменения, индуцированные P4, были значительно обогащены генами, связанными с заболеваниями, которые, как известно, модулируются во время беременности, такими как MS, RA и псориаз.Факторы транскрипции, ассоциированные с T H 1 и T H 17, STAT1 и STAT3 были значительно подавлены P4, и их нижестоящие мишени были значительно обогащены среди генов, связанных с заболеваниями. Некоторые из этих генов включали хорошо известные и релевантные для заболевания цитокины, такие как IL-12β, CXCL10 и OSM, которые были дополнительно проверены также на уровне белка с использованием анализа расширения близости. Наши результаты расширяют предыдущие знания о P4 как о гормоне, регулирующем иммунную систему, и подтверждают его важность во время беременности для регулирования потенциально пагубных иммунных реакций на полуаллогенный плод.Кроме того, наши результаты также указывают на потенциальную роль P4 в иммуномодуляции заболеваний, вызванных беременностью, предположительно за счет ослабления иммунных ответов, связанных с T H 1 и T H 17, и подчеркивает необходимость дальнейших исследований, оценивающих P4 как вариант будущего лечения.

ВВЕДЕНИЕ

Беременность представляет собой уникальное иммунологическое состояние, поскольку иммунная система матери способна переносить присутствие полуаллогенного плода. Считается, что эта иммунологическая толерантность возникает из-за обширных иммунных и эндокринных изменений, вызванных во время беременности 1, 2 , спровоцированных повышенным уровнем стероидного гормона прогестерона (P4), который необходим для установления и поддержания беременности. 3–5 Соответственно, низкие уровни P4 были связаны с несколькими осложнениями беременности 6–8 и, фактически, лечение антагонистом P4-рецепторов мифепристоном (RU486) приводит к прекращению беременности, 9 дальнейшая поддержка важность P4 при беременности. Интересно, что терапевтическое использование P4 во время беременности снижает риск преждевременных родов в определенных группах риска, 10 подчеркивая потенциальное использование P4 для лечения осложнений беременности.

Роль P4 в основном связана с его влиянием на гомеостаз и ремоделирование миометрия. 11 Однако на важную иммуномодулирующую роль P4 in vivo указывает улучшение, связанное с беременностью, и последующее ухудшение воспалительных заболеваний, таких как рассеянный склероз (РС) и ревматоидный артрит (РА), что совпадает с моменты времени во время и после беременности, когда уровни P4 являются соответственно самыми высокими и самыми низкими. 12–14 Кроме того, наблюдались различия в иммунных ответах, связанных с высоким и низким уровнями P4 во время менструального цикла. 15, 16 Предыдущие исследования иммунно-эндокринных взаимодействий в значительной степени были сосредоточены на том, как эстроген влияет на иммунную систему. Интересно, что уровень эстрогена увеличивается и уменьшается во время беременности аналогично P4. Однако эстроген, по-видимому, обладает как иммунорегулирующими, так и иммуноактивирующими свойствами. 17 Действительно, эстроген был предложен в качестве основного фактора, объясняющего учащение аутоиммунных заболеваний у женщин. 18 С другой стороны, in vitro эффекты P4 на различные популяции иммунных клеток подтверждают ключевую роль P4 в регулировании иммунных ответов, которые могут иметь центральное значение для стимулирования толерантности плода. 19–24 Кроме того, роль P4 как мощного иммуносупрессора подтверждается исследованиями in vivo , показывающими участие P4 в ответ на аллогенную и ксеногенную трансплантацию и отторжение трансплантата у людей.

CD4 + Т-клетки занимают центральное место в иммунной системе, выступая в качестве главных регуляторов иммунитета и толерантности. 29 Важность CD4 + Т-клеток во время беременности очевидна по их относительному исключению на границе плод-мать, чтобы ограничить потенциально пагубную активацию, 30 , тогда как регуляторные Т-клетки обогащены, тем самым еще больше ограничивая вредные Т-клетки. ответы. 31, 32 Параллельно ограничение активации Т-клеток CD4 + является важным аспектом при заболеваниях, опосредованных Т-клетками, поскольку аберрантная активация аутореактивных Т-клеток CD4 + является центральным механизмом в патогенезе заболевания. 33 Таким образом, регуляция Т-лимфоцитов CD4 + является общим знаменателем, который может предотвращать нежелательные материнские иммунные ответы на плод, а также объяснять улучшение воспалительных заболеваний во время беременности. Интересно, что было показано, что P4 ограничивает активацию Т-клеток CD4 + . 34–36 Однако до сих пор не проведен глубокий анализ точных эффектов P4 на активацию Т-клеток CD4 + человека и его потенциального участия в модуляции заболевания во время беременности.

Здесь мы сообщаем подробные данные секвенирования РНК, демонстрирующие глубокое прямое влияние P4 на активацию Т-клеток. Более конкретно, P4 индуцировал большие транскриптомные изменения, наиболее заметно снижающие регуляцию, в иммуноассоциированных генах и путях, и что интересно, эти гены были значительно обогащены генами, связанными с заболеваниями, которые, как известно, модулируются во время беременности, включая MS и RA.Эти изменения были в основном связаны с STAT1 и STAT3 и их нижележащими мишенями, что указывает на возможное участие P4 в подавлении иммунных ответов, связанных с T H 1 и T H 17, имеющих отношение к заболеванию. Эти данные свидетельствуют о том, что P4 может участвовать в улучшении некоторых воспалительных заболеваний, вызванных беременностью, и представляет собой потенциальный путь для будущих вариантов лечения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Прогестерон подавляет активацию Т-клеток и влияет на транскриптомный профиль активированных CD4

+ Т-лимфоцитов

Чтобы изучить влияние Р4 на CD4 + Т-клетки и активацию Т-клеток, мы установили в vitro , где первичные человеческие CD4 + Т-клетки были сначала предварительно инкубированы с P4 перед активацией, что отражает ситуацию in vivo , когда Т-клетки будут постоянно подвергаться воздействию P4 до заражения антигеном.Затем клетки культивировали неактивированными или с обычно используемой комбинированной активацией через рецептор Т-клеток (анти-CD3) и костимулирующий CD28 (анти-CD28) в присутствии или в отсутствие P4 в течение 6, 24 и 72 часов ( рис. . 1а ). Эти временные точки были выбраны для того, чтобы в основном уловить влияние P4 на клеточные и транскриптомные события, вовлеченные в активацию Т-клеток, ведущую к клональной экспансии и дифференцировке. Мы использовали уровень стимуляции от низкого до умеренного, измеренный по доле активированных Т-клеток, экспрессирующих маркеры поверхностной активации (6 часов CD69, среднее ± стандартное отклонение неактивированных: 0.2% + 0,04, активированный: 15% ± 9,5 и 24 часа CD69, неактивированный: 0,2% + 0,07, активированный: 20% + 9,4; CD25, неактивированный: 6,5% ± 1,4, активированный: 16% ± 4,7) ( Рис. 1b-d ). Активация Т-клеток CD4 + в присутствии различных концентраций P4 снижала уровень активации клеток дозозависимым образом, со снижением доли как клеток, экспрессирующих CD69, так и CD25, при воздействии самой высокой концентрации P4 (50 мкМ) привело к наибольшему общему снижению (6 часов: CD69 + p <0.010, изменение в 0,4 + 0,1 раза по сравнению с активацией без P4 p <0,0001; 24 часа: CD69 + p <0,001, 0,4 + 0,1-кратное изменение p <0,0001 и CD25 + p <0,0001, 0,5 + 0,1-кратное изменение p <0,0001) (рис. 1b -d и дополнительный рис.1) . Затем мы выполнили транскриптомный анализ с использованием секвенирования РНК (RNA-Seq) на CD4 + T-клетках, активированных в течение 6 и 24 часов в присутствии (50 мкМ P4) или в отсутствие P4 вместе с неактивированными клетками, чтобы получить более глубокое картина того, как P4 влияет на активацию Т-клеток.Чтобы получить общее представление о транскриптомных изменениях, мы выполнили неконтролируемую кластеризацию образцов с использованием многомерного масштабирования, которое показало четкие различия между клетками, активированными в присутствии или в отсутствие P4, а также по сравнению с неактивированными клетками (рис. 1д-е) . Действительно, анализ дифференциальной экспрессии показал, что P4 индуцировал значительные изменения в профиле экспрессии генов активированных Т-клеток CD4 + как через 6, так и через 24 часа (по сравнению с активацией в отсутствие P4), в дальнейшем называемых генами ответа P4. .В целом, воздействие P4 привело к 4276 дифференциально экспрессируемым генам (DEG, частота ложных обнаружений (FDR) ≤0,05; 2080 с повышенной и 2196 с пониженной регуляцией) через 6 часов и 4756 DEG (2340 с повышенной и 2416 с пониженной регуляцией) через 24 часа (Рис. 1g-h) .

Рис. 1.

Прогестерон подавляет активацию Т-клеток и вызывает транскриптомные изменения в активированных Т-клетках CD4 + . a Первичные CD4 человека + Т-клетки были выделены у здоровых небеременных женщин и предварительно инкубированы с или без различных концентраций (10, 30 и 50 мкМ) P4 в течение 20 часов, а затем культивированы неактивированными или активированными in vitro. связанных с планшетом анти-CD3 и анти-CD28 антител в присутствии или в отсутствие P4 в течение 6-24-72 часов.Образцы, культивированные в течение 72 часов, использовали только для измерения секретируемых белков. Влияние Р4 на активацию Т-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии, секвенирования РНК и анализа близости секретируемых белков в культуральных супернатантах. B Влияние Р4 на маркеры активации Т-клеток CD69 (6 и 24 часа) и CD25 (только 24 часа). ) был проанализирован методом проточной цитометрии (n = 11-13). Гистограммы показывают процентное содержание Т-клеток CD4 + , экспрессирующих маркеры активации Т-клеток. Показано среднее ± стандартное отклонение.* p≤0,05, ** p≤0,01, *** p≤0,001, **** p≤0,0001. c-d Анализ многомерного масштабирования данных экспрессии генов, полученных путем секвенирования РНК (n = 3 неактивированных, n = 8 для активированных с и без 50 мкМ P4). Группы были выделены цветом фона только для схематических целей. e-f Volcano графики транскриптомного анализа дифференциально экспрессируемых генов в Т-клетках CD4 + , активированных в присутствии P4 по сравнению с отсутствием P4. Черные точки FDR≤0.05. P4, прогестерон.

Анализ обогащения набора генов показывает преимущественно подавляющий эффект прогестерона на связанные с иммунитетом пути, затрагивающие, в частности, гены, связанные с активацией Т-клеток

Чтобы получить более полное представление о функциональном значении генов ответа P4, мы провели анализ обогащения набора генов ( GSEA). Некоторые иммунные пути, связанные с передачей сигналов Т-лимфоцитами и ниже по ней, были значительно подавлены Р4 как через 6, так и через 24 часа, например, передача сигналов рецептора Т-клеток, передача сигналов JAK-STAT, взаимодействия цитокин-цитокиновый рецептор, а также многие иммуноассоциированные пути заболевания (рис.2a-b и дополнительная таблица 1). Через 24 часа несколько путей, связанных с дифференцировкой Т-клеток (дифференцировка Th2, Th3 и Th27), также были затронуты P4. Поразительно, но GSEA продемонстрировал, что очень мало путей активируется с помощью P4, хотя было почти равное количество генов ответа P4, которые были активированы и подавлены. Кроме того, ни один из активированных путей не был связан с иммунитетом (дополнительная таблица 1).

Рис. 2.

Многие иммунные пути подавляются в CD4 + Т-клетках, активированных в присутствии прогестерона. a-b Гистограммы, показывающие нормализованную оценку обогащения на оси x из анализа обогащения набора генов KEGG генов ответа P4 (DEG сравнивают активацию в присутствии P4 по сравнению с активацией только) через 6 и 24 часа. Все пути имеют скорректированное значение p FDR <0,05. c-d Диаграммы Венна перекрывающихся DEG между активируемыми и подавляющими генами в Т-клетках, активированных в присутствии или в отсутствие 50 мкМ P4. ДЭГ, дифференциально экспрессируемые гены: OR, отношение шансов: P4, прогестерон.

Поскольку нами и другими исследователями 24, 35 было обнаружено, что P4 оказывает подавляющее действие на активацию Т-клеток, мы исследовали, связаны ли изменения, вызванные P4, с генами, участвующими в самом процессе активации Т-клеток. Поэтому мы оценили, может ли P4 противодействовать изменениям, вызванным во время активации, анализируя перекрытие между генами ответа P4 и генами, участвующими в активации Т-клеток, то есть . гены, дифференциально экспрессирующиеся в активированных против неактивированных Т-клеток.В самом деле, наблюдалось значительное перекрытие между DEG, активируемыми во время активации Т-клеток, и генами, подавленными с помощью P4 (6 часов: отношение шансов (OR): 9,1, p = 2,6 × 10 -220 ; 24 часа: OR: 16,1, p = 1,6 × 10 -481 ; Рис. 2c ) и между DEG, подавляемыми во время активации Т-клеток и активируемыми P4 (6 часов: OR: 4,4, p = 1,6 × 10 -125 ; 24 часа: OR : 5.1, p = 5.9 × 10 -195 ; Fig. 2d ), демонстрируя, что P4 значительно влияет на гены, связанные с фактической активацией Т-клеток, противодействуя некоторым изменениям, индуцированным во время активации.Напротив, очень немногие гены показали такую ​​же направленность по сравнению с активацией только Р4 и Т-клеток (данные не показаны).

Демпфирующий эффект P4 на экспрессию генов CD4

+ Т-клеток очевиден также на уровне секретируемого белка

Чтобы выяснить, оказывает ли P4 эффект на протеомном уровне, мы провели скрининг 92 белков, связанных с воспалением. в культуральных супернатантах, собранных через 6, 24 и 72 часа, с использованием анализа расширения близости (PEA) с высокой чувствительностью и специфичностью. 37 Через 6 часов были обнаружены только 24 из 92 белков, из которых 14 белков по-разному экспрессировались между CD4 + Т-клетками, культивированными в присутствии по сравнению с в отсутствие P4 ( Рис. 3a и Дополнительная таблица 2 ).

Рис. 3.

P4 значительно подавляет экспрессию белка в супернатантах культур. Панель белков, связанных с воспалением, измеряли в супернатантах, собранных из CD4 + Т-клеток, которые культивировались неактивированными или активированными с использованием или без 50 мкМ P4. а. Volcano графики дифференциально экспрессируемых белков (DEP) через 6, 24 и 72 часа, сравнивающие активацию в присутствии или в отсутствие P4. DEP определяли с помощью теста Фридмана и Бенджамини-Хохберга. Данные представлены как разница в нормированных значениях экспрессии белка (NPX), предоставленных производителем. Синие точки DEP подавляют регуляцию P4, красные точки активируют DEP, а серые точки FDR≤0,05. б-д. Тепловые карты дифференциально экспрессируемых белков, сравнивающие активацию в присутствии P4 и только активацию.ns представляют собой белки, которые существенно не различались между активацией и неактивированными. Медианные значения NPX показаны на рисунке. ns = не имеет значения. d. Диаграмма Венна, показывающая количество уникальных и общих DEP в разные моменты времени.

Через 24 часа 39 из 92 белков были обнаружены, и 28 (72%) из них были дифференциально экспрессированы, а через 72 часа 65 белков были обнаружены, но только 23 (35%) экспрессировались дифференциально ( Рис. 3a и Дополнительная таблица 2 ).В соответствии с транскриптомными данными, большинство дифференциально экспрессируемых белков (DEP) были значительно ниже в супернатантах, собранных из Т-клеток, которые были активированы в присутствии P4, по сравнению с активацией отдельно. Только три белка (ADA, CXCL5 и EIF4EBP1) были активированы в любой момент времени. Также на уровне белка P4, по-видимому, противодействовал изменениям, индуцированным во время активации, когда большинство белков, которые значительно усиливались во время активации Т-клеток (по сравнению с неактивированными клетками), подавлялись с помощью P4 ( рис.3b-d ), за исключением ADA (24 и 72 часа), CCL8 (72 часа), CXCL5 (24 часа), EIF4EBP1 (24 часа), IL-6 (72 часа) и TNFSF12 (24 часа). Было пять белков, которые постоянно подавлялись во всех трех временных точках: CXCL8, CCL8, IL-17A, TNF и FLT3LG (, фиг. 3d, ). Таким образом, подавляющий эффект P4 на связанные с иммунной системой процессы на транскриптомных уровнях дополнительно подтверждается его очевидным подавляющим действием на белки, связанные с воспалением.

Прогестерон значительно подавляет гены, связанные с иммуноопосредованными заболеваниями, которые модулируются во время беременности

Тот факт, что уровни P4 во время беременности совпадают с клиническими изменениями, наблюдаемыми при некоторых иммуноопосредованных заболеваниях, побудил нас исследовать, могут ли гены, затронутые P4, и.e . гены ответа P4 были связаны с известными генами болезней. С этой целью мы использовали связанные с заболеванием гены, полученные из DisGeNET 38 , для семи заболеваний, которые, как было показано ранее, изменяются во время беременности 39 : болезнь Хашимото, болезнь Грейвса, рассеянный склероз, псориаз, РА, системная красная волчанка ( СКВ) и системный склероз. Мы объединили гены ответа P4 как через 6, так и через 24 часа, чтобы определить, влияет ли P4 на гены, относящиеся к заболеванию, в результате чего в общей сложности было получено 2563 гена с пониженной регуляцией и 2403 гена с повышенной регуляцией, которые дифференциально экспрессировались с P4 в течение 24 часов.В соответствии с предыдущим открытием гораздо более выраженного подавляющего действия P4 на гены, связанные с иммунитетом, гены ответа P4 с подавленной реакцией были значительно обогащены генами, связанными со всеми семью заболеваниями; Болезнь Хашимото (n = 51, OR: 2,6, p = 1,6 × 10 -7 ), болезнь Грейвса (n = 73, OR: 2,0, p = 2,3 × 10 -6 ), псориаз (n = 134 , OR: 1,4, p = 5,8 × 10 -4 ), MS (n = 201, OR: 1,6, p = 7,0 × 10 -8 ), RA (n = 270, OR: 1,3, p = 6,8 × 10 -4 ), СКВ (n = 212, ИЛИ: 1.7, p = 1,4 × 10 -9 ) и системный склероз (n = 96, OR: 1,5, p = 8,5 × 10 -4 ) (рис. 4a, дополнительная таблица 3) , тогда как усиленный ответ P4 гены не показали значительного обогащения какими-либо связанными с заболеванием генами (рис. 4a) Таким образом, для последующего анализа рассматривались только гены ответа P4 с пониженной регуляцией. Всего было 17 общих генов между всеми семью заболеваниями, которые были значительно подавлены P4: BCL2, CXCL10, FAS, FOXP3, ICAM1, IL10, IL17A, IL1A, IL1B, IL21, IL22, IL23R, IL2R, ISG20, RBM45, TGFB1 и TNF (рис.4a, дополнительная таблица 3) , выделяя потенциальные центральные гены в патогенезе заболевания.

Рис. 4.

Прогестерон подавляет гены, связанные с заболеванием, для нескольких аутоиммунных заболеваний, в частности, через STAT1 и STAT3 . Влияние P4 на гены, связанные с заболеванием, и вышестоящие факторы транскрипции исследовали с использованием известных генов болезни (полученных из DisGeNET), а взаимодействия TF-мишени были основаны на TRRUST и DoRothEA. a Обогащение связанных с заболеванием генов семи аутоиммунных заболеваний среди дифференциально экспрессируемых генов с помощью P4.DEG с пониженной регулировкой = синие столбцы, DEG с повышенным уровнем = красные столбцы. ДЭГ определяли, сравнивая клетки, активированные в присутствии Р4, с активацией отдельно, и представляли общее количество уникально экспрессируемых генов через 6 и 24 часа вместе. Пунктирная линия показывает p = 0,05. Гены, которые являются общими для всех семи заболеваний среди генов, дифференциально подавляемых с помощью P4, показаны над полосами. Значения p обогащения рассчитывали с помощью точного критерия Фишера. ТФ с наибольшим числом взаимодействующих генов среди ассоциированных с заболеванием генов с дифференцированной подавлением экспрессии для b общих генов семи различных заболеваний (из 36 всего TF) и c общих генов между MS, RA и псориазом (out всего 57 ТФ). d-e Схематическое изображение Stat1 и Stat3 и их взаимодействующих генов. Stat1 и Stat3 значительно подавлен P4, как и их цели, изображенные на рисунке. ДЭГ, дифференциально экспрессируемые гены: MS, рассеянный склероз: P4, прогестерон: RA, ревматоидный артрит: TF, фактор транскрипции.

Связанные с заболеванием изменения, вызванные P4, обогащены целевыми значениями для T

H 1-связанный STAT1 и T H 17-связанный STAT3

Чтобы получить более полное представление о влиянии P4 на болезнь -ассоциированные изменения, мы стремились идентифицировать вышестоящие регуляторы генов пораженных заболеваний.Используя известные подтвержденные взаимодействия фактора транскрипции (TF) с мишенью из TRRUST 40 и DoRothEA, 41 , мы идентифицировали в общей сложности 36 TF, которые вместе регулируют 12 из 17 общих генов болезней. T H 1- и T H 17-ассоциированные TF STAT1 и STAT3 были значительно подавлены P4 и имели наибольшее количество генов-мишеней. Кроме того, мишени STAT1 и STAT3 были значительно обогащены среди генов болезни (STAT1: n = 9, OR: 9.5, р = 0,0004; STAT3: n = 7, OR: 11,8, p = 0,0001) (рис. 4b, дополнительная таблица 4) . Затем мы сосредоточились на MS, RA и псориазе, которые, как было показано, заметно улучшаются во время беременности, 42–44 , чтобы более конкретно определить, на какие TF и ​​гены влияет P4. Всего было 62 общих гена между тремя заболеваниями, которые были значительно подавлены P4 (дополнительная таблица 5) . Всего было изображено 57 различных TF, которые регулируют 39 из этих общих генов (2.6 среднее число взаимодействий на TF), где снова мишени для STAT1 и STAT3 были значительно обогащены среди общих генов, связанных с заболеванием (STAT1: n = 19, нацелено на 48% общих генов, OR: 3,2, p = 0,001; STAT3: n = 14, нацеленность на 36% общих генов, OR: 5,6, p = 3,0 × 10 -5 ) (рис. 5c-e, дополнительная таблица 5) . Таким образом, подавляющий эффект P4 на гены, связанные с заболеванием, по-видимому, в первую очередь опосредуется нацеливанием на STAT1 и STAT3 и их нижележащие мишени.

Связанные с заболеванием транскриптомные изменения, вызванные P4, отражаются на уровне протеомики

Чтобы еще больше подчеркнуть роль P4 в связанном с беременностью улучшении MS, RA и псориаза, мы исследовали, отражаются ли связанные с заболеванием транскриптомные изменения на уровне белка. Таким образом, мы идентифицировали белки, в которых известные взаимодействующие TF также были значительно затронуты P4, а связанный с заболеванием ген, а также соответствующий белок были значительно подавлены P4.Мы объединили все белки, которые были значительно подавлены P4 через 6, 24 и 72 часа, чтобы получить глобальную карту протеомных изменений, в результате чего получился 41 DEP. Сосредоточившись на STAT1 и STAT3, мы обнаружили, что несколько связанных с заболеванием белков ниже STAT1 и STAT3 значительно снижены на P4: IL-12β (STAT1), IL-10 (STAT1, STAT3), IL-2 (STAT3), CXCL10 ( STAT1), OSM (STAT3) и TFG-β1 (STAT3) (Таблица 1) . Кроме того, мы обнаружили три дополнительных белка, которые также были связаны с заболеванием и соответствующие гены которых были значительно подавлены P4: TNF, TNFSF10 и IL-13 (Таблица 1) .Таким образом, для девяти белков, связанных с воспалением, мы можем подтвердить, что транскриптомные изменения, индуцированные P4, также отражались на протеомных уровнях. Взятые вместе, P4 значительно влияет на экспрессию TF, приводя к подавлению взаимодействующих генов, связанных с заболеванием, что, в свою очередь, снижает экспрессию соответствующих белков.

Таблица 1.

Гены и белки, ассоциированные с заболеванием, и соответствующие им факторы транскрипции, на которые значительно влияет P4.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании мы демонстрируем, что P4 значительно подавляет активацию Т-клеток, что дает убедительное объяснение того, как ответы Т-клеток потенциально могут регулироваться во время беременности, когда уровни P4 высоки и требуется иммунная регуляция.Транскриптомный анализ показал, что P4 значительно изменяет профиль экспрессии генов, подавляя связанные с иммунитетом гены и пути, такие как JAK-STAT и передачу сигналов рецептора Т-клеток. Интересно, что транскриптомные изменения, индуцированные P4, были сильно обогащены генами, связанными с иммуноопосредованными заболеваниями, которые, как известно, модулируются во время беременности, такие как MS, RA, псориаз и SLE. Кроме того, STAT1 и STAT3 были выделены как центральные регуляторы, и несколько нижестоящих мишеней были значительно подавлены P4, также на уровне белка, включая несколько хорошо известных и значимых для болезни цитокинов.Наши результаты расширяют предыдущие знания о P4 как иммунорегулирующем гормоне и предоставляют дополнительные знания о том, как P4 влияет на активацию Т-клеток CD4 + и его потенциальное участие в модуляции связанного с беременностью заболевания, наблюдаемого при нескольких иммуноопосредованных заболеваниях. В совокупности наши результаты показывают, что P4 играет важную роль в иммуномодуляции, вызванной беременностью, в частности, влияя на связанные с заболеванием ответы T H 1 и T H 17.Наши результаты открывают путь к исследованию новых терапевтических режимов, имитирующих ситуацию беременности, при иммуноопосредованных заболеваниях.

Предыдущие исследования изучали влияние P4 на активацию лимфоцитов и CD3 + Т-клеток. 35, 45–48 Однако настоящее исследование, насколько нам известно, является не только первым исследованием, в котором непосредственно оценивается влияние P4 на активацию Т-клеток CD4 + человека, но и первым исследованием, в котором выполнено углубленное транскриптомное профилирование для расшифровки эффекты P4.Используя систему активации Т-клеток in vitro, было обнаружено, что Р4 последовательно ингибирует активацию Т-клеток, о чем свидетельствует снижение экспрессии маркеров активации клеточной поверхности и глубокое подавление иммунных генов и белков. Кроме того, изменениям, которые были конкретно связаны с фактической активацией Т-клеток, действительно противостоял P4, , то есть . гены и белки, повышенная регуляция во время активации Т-клеток, подавлялась с помощью P4 и , наоборот, .Активация Т-клеток действительно является важной контрольной точкой для иммунной регуляции как в отношении толерантности к беременности 49 , так и аутоиммунитета 33, 50 , и было показано, что введение Р4 предотвращает вызванные активацией Т-клеток преждевременные роды и преждевременные роды на животной модели, 51 подчеркивает важность P4 в контроле активации Т-клеток во время беременности.

P4 был предложен в качестве одного потенциального кандидата для индуцированной беременностью иммунной модуляции нескольких аутоиммунных заболеваний, учитывая его корреляцию с активностью заболевания во время беременности.Действительно, предварительное лечение P4 при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (EAE) на животной модели рассеянного склероза ослабляло тяжесть заболевания и уменьшало воспалительные реакции. 52, 53 Кроме того, даже после начала EAE введение P4 могло значительно снизить тяжесть заболевания. 54 Наши данные о том, что P4-индуцированные гены были значительно обогащены связанными с заболеванием генами, относящимися к нескольким аутоиммунным заболеваниям, которые, как известно, модулируются во время беременности, обеспечивают дополнительную поддержку возможного участия P4 в модулирующей активности этого заболевания.Интересно, что при всех заболеваниях существует несколько перекрывающихся генов, что указывает на потенциально общие механизмы модуляции этих заболеваний, вызванной беременностью.

Было очевидно, что преобладающее действие P4 на гены, ассоциированные с заболеванием, в первую очередь связано с ответами T H 1 и T H 17. В самом деле, STAT1 и STAT3 являются центральными для стимулирования дифференцировки T H 1 и T H 17 соответственно, оба из которых вовлечены в патогенез некоторых аутоиммунных заболеваний.Например, было показано, что потеря экспрессии STAT3 в Т-клетках обеспечивает защиту от EAE 55 , а высокие уровни STAT3 можно использовать для прогнозирования конверсии клинически изолированного синдрома в определенный MS. 56 Кроме того, нацеливание на STAT3 было предложено в качестве потенциального терапевтического подхода при таких заболеваниях, как MS, псориаз и RA, где T H 17 играет важную роль в процессах заболевания. 57–59 Ранее было показано, что P4 подавляет иммунные ответы, связанные как с T H 1, так и с T H 17 20, 60–63 , и предполагается, что он играет важную роль в отказе от T H 1 / T H 17 в пользу большего количества ответов T H 2 / T reg во время беременности. 19 Однако, насколько нам известно, ранее он не был показан как возможный механизм модуляции активности заболевания, вызванной беременностью. Наши транскриптомные данные были подтверждены на уровне белка для нескольких очень релевантных болезней-мишеней ниже STAT1 и STAT3 . Нацеливание на IL-12β (IL12p40), который представляет собой перекресток между T H 1-ассоциированным IL-12 и T H 17-связанным IL-23, успешно применяется для лечения псориаза и проходит клинические испытания для нескольких других иммуноопосредованные воспалительные заболевания. 64 Очевидно, что IL-12β играет важную роль в заболевании, и подавляющий эффект P4 на этот ген и последующая экспрессия белка могут, таким образом, составлять возможный путь в модуляции болезни с помощью P4. Примечательно, что P4 не только подавлял провоспалительные, но и противовоспалительные гены и белки, такие как IL-10 и TGF-β, что указывает на то, что P4 вызывает довольно общее подавление иммунных ответов. Хорошо известно, что противовоспалительные реакции часто индуцируются как механизм отрицательной обратной связи во время воспаления, чтобы помочь предотвратить чрезмерные воспалительные реакции и помочь восстановить гомеостаз тканей.Предположительно, поскольку P4 ослабляет иммунные ответы, естественно предположить, что в результате последуют меньшие противовоспалительные реакции. Это иллюстрируется сложной взаимосвязью между STAT3 и IL-10, где промотор IL10 содержит специфический мотив связывания для STAT3, который, по-видимому, контролирует экспрессию IL10. 65 Действительно, повышенная экспрессия STAT3 в Т-клетках пациентов с СКВ способствовала экспрессии IL-10 66 , и аналогичные ассоциации были предложены также между STAT3 и TGF-β. 67, 68 В совокупности сильное подавление активации Т-лимфоцитов CD4 + , включая несколько путей, связанных с T H 1 и T H 17, указывает на то, что P4 способен подавлять провоспалительные реакции.

В свете наших результатов есть соблазн предположить о потенциальном благоприятном терапевтическом эффекте P4 при аутоиммунных заболеваниях. У людей, хотя и косвенно, но об ухудшении симптомов перед менструацией, когда уровни P4 ниже, как при РА, так и при рассеянном склерозе. 69–71 Несмотря на то, что предыдущее клиническое испытание с использованием высоких доз прогестинов (синтетических прогестагенов) не помогло предотвратить послеродовые рецидивы у пациентов с РС, 72 оно не исключает возможности использования прогестагенов в качестве потенциального лечения. Поскольку период после родов связан с общими драматическими изменениями, не только в уровне гормонов, но и в обращении иммунной системы к состоянию до беременности, неудивительно, что никаких явных эффектов не наблюдалось.Прогестагены по-прежнему представляют собой очень привлекательный вариант лечения, поскольку они могут различаться по своему сродству к андрогенам, прогестерону и глюкокортикоидным рецепторам и, следовательно, теоретически могут оказывать очень разнообразное воздействие на различные аспекты патогенеза заболевания. Таким образом, было бы полезно изучить терапевтический потенциал прогестагенов.

Одним из потенциальных ограничений нашего исследования является то, что мы исследовали эффект P4 у здоровых женщин. Насколько нам известно, нет исследований, которые бы специально оценивали, будут ли пациенты с аутоиммунными заболеваниями иначе реагировать на P4, чем здоровые люди.Однако, если рассматривать P4 как потенциальный вариант лечения, это требует дальнейшего изучения. Кроме того, реакция на P4 может варьироваться, поскольку экспрессия рецепторов, связанных с P4, может варьироваться на протяжении менструального цикла. 73, 74 Женщины, включенные в это исследование, были отобраны равномерно в течение менструального цикла, что должно минимизировать смещение различий в экспрессии рецепторов. Кроме того, все включенные женщины последовательно ответили на P4. Еще одно остающееся предостережение, которое нам еще предстоит решить, — это понимание точных механизмов, с помощью которых работает P4.Это осложняется тем фактом, что P4 — это гормон беспорядочного обмена, который может связывать несколько мишеней. Существуют противоречивые результаты относительно экспрессии различных рецепторов, связанных с P4, в Т-клетках CD4 + . 23, 35, 48, 75 Кроме того, остается неясным, работает ли P4 в основном за счет более медленных геномных или более быстрых негеномных воздействий через ядерные или мембранные рецепторы соответственно. Интересно, что лимфоциты беременных по сравнению с небеременными женщинами, по-видимому, имеют повышенную чувствительность к P4, 76 , что, как предполагается, связано с более активной иммунной системой во время беременности, вызванной присутствием полуаллогенного плода.Кроме того, было показано, что P4 взаимодействует с рецептором глюкокортикоидов (GR) 77, 78 , и было показано, что синтетический кортикостероид дексаметазон оказывает аналогичные эффекты на дифференцировку Т-клеток, как и P4. 63 Принимая во внимание используемые здесь концентрации, нельзя исключить, что некоторые из наблюдаемых эффектов связаны с связыванием с GR.

Таким образом, мы показали, что присутствие P4 значительно снижает активацию CD4 + Т-клеток и индуцирует большие транскриптомные изменения в активированных клетках.Наиболее заметно подавляемые P4 иммунные ответы, связанные с активацией Т-клеток, и гены, на которые воздействует P4, были значительно обогащены связанными с заболеванием генами иммуноопосредованных заболеваний, которые, как известно, модулируются во время беременности. Наиболее выраженный эффект P4 на гены, связанные с заболеванием, был в первую очередь связан с ответами T H 1 и T H 17. Мы пришли к выводу, что наше исследование подтверждает роль P4 в иммуномодуляции, индуцированной во время беременности, и что P4 следует дополнительно оценивать как потенциальный вариант лечения при опосредованном Т-клетками заболевании.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования

Образцы крови были взяты у тринадцати здоровых женщин-добровольцев (средний возраст 32 года, 25-43 года), отобранных среди студентов и персонала Университета Линчёпинга и Университетской больницы Линчёпинга, Швеция. Информированное согласие было получено до сбора образцов, и исследование было одобрено Региональным советом по этике в Линчёпинге (Regionala etikprövningsnämnden i Linköping), Швеция (номер одобрения: M39-08). На момент включения ни одна из женщин не использовала гормональные контрацептивы или какие-либо другие лекарства.Моменты сбора образцов были равномерно распределены по менструальному циклу (предполагая, что менструальный цикл длился 28 дней; семь женщин находились в лютеиновой фазе и шесть — в фолликулярной фазе).

Выделение CD4

+ Т-клеток

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяли градиентным центрифугированием с использованием Lymphoprep ™ (Axis-Shield, Осло, Норвегия) и трижды промывали в сбалансированном солевом растворе Хэнка (Life Technologies, Дармштадт, США). Германия). Магнитно-активированная сортировка клеток (MACS) была использована для выделения CD4 + Т-клеток.PBMC ресуспендировали в буфере MACS (фосфатно-солевой буфер, PBS; Medicago, Упсала, Швеция) с добавлением 2 мМ ЭДТА (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 0,5% фетальной бычьей сыворотки (FBS; Thermo Fisher Scientific, Waltham, США). Массачусетс, США) и клетки CD4 + выделяли с помощью положительной иммуномагнитной селекции с использованием колонок MS и мини-сепаратора MACS (Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Германия) в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем. Чистоту выделенных CD4 + Т-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии (средняя чистота 98.5%, диапазон 97,6-99,0%).

Предварительная инкубация с прогестероном

Выделенные CD4 + Т-клетки предварительно инкубировали с 10, 30 и 50 мкМ P4 (водорастворимый; Sigma Aldrich) или без него (только среда для культивирования клеток). Клетки высевали в 24-луночные планшеты с плоским дном (Costar ™; Corning Inc, Корнинг, Нью-Йорк, США) при 1,0 × 10 6 клеток / мл в конечном объеме 1 мл / лунку среды Дульбекко, модифицированной Isocove ( IMDM; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) с добавлением L-глутамина (292 мг / л; Sigma-Aldrich), незаменимых аминокислот MEM 100X (10 мл / л; Gibco ® ), пенициллина (50 МЕ / мл), стрептомицин (50 мкг / мл; Cambrex-Lonza, Базель, Швейцария) и бикарбонат натрия (3.024 г / л; Sigma-Aldrich) и 5% FBS при 37 ° C и 5% CO 2 . Через 20 часов клетки удаляли с планшетов, центрифугировали и ресуспендировали в среде для культивирования клеток перед стимуляцией in vitro . См. Рис. 1a для обзора экспериментального дизайна исследования.

In vitro Активация CD4 + Т-клеток в отсутствие или в присутствии P4

Двадцать четыре луночные планшеты с плоским дном (Costar ™) были покрыты 0,1 мкг / мл низкоэндотоксинового анти-CD3 и антибиотика. -CD28 антитела (клон UCHT1, клон YTH913.12; Bio-Rad AbD Serotec Limited, Геркулес, Калифорния, США) или только PBS в течение 20 часов при 4 ° C с последующей трехкратной промывкой в ​​PBS. Концентрация антител была выбрана на основании экспериментов по титрованию, где 0,1 мкг / мл приводило к умеренно повышенной экспрессии на клеточной поверхности маркера ранней активации Т-клеток CD69. Т-клетки CD4 + , предварительно инкубированные без P4, культивировали неактивированными или активированными (с антителами против CD3 / CD28), тогда как Т-клетки CD4 + , предварительно инкубированные с P4, были активированы в присутствии тех же концентраций, что и во время предварительной инкубации в течение 6-24-72 часов и последующей обработки для проточной цитометрии, экстракции РНК или измерения секретируемых белков.Клетки, культивированные в течение 72 часов, использовали только для измерения белка. Вкратце, после культивирования супернатанты собирали, часть клеток использовали для анализа проточной цитометрии, а остальные лизировали и гомогенизировали в буфере RLT Plus (Qiagen; Hilden, Германия) с добавлением 143 мМ β-меркаптоэтанола (Sigma Aldrich) и гомогенизировали. с помощью шприца и иглы в соответствии с инструкциями производителя. Лизаты хранили при -70 ° C перед экстракцией.

Оценка статуса активации с помощью проточной цитометрии

Т-клетки CD4 + ресуспендировали в фиксируемом красителе мертвых клеток LIVE / DEAD ™ (Invitrogen), разведенном 1: 500 в PBS + 0.1% FBS и окрашены мышиными антителами к CD4-FITC человека (клон SK3), CD69-APCCy7 (клон FN50), CD25-PE (клон 2A3) и CD3-APC (клон SK7; все от BD Biosciences, Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси , США). Клетки инкубировали в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре и промывали PBS + 0,1% FBS перед анализом проточной цитометрии. 10 000 CD4 + Т-клеток были собраны и проанализированы с использованием FACS Canto II (BD Biosciences) и версии 2.1 программного обеспечения Kaluza (Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США). Клетки были заблокированы в соответствии с прямым (FSC) и боковым рассеянием (SSC) и далее определены как CD3 + CD4 + (дополнительный рис.2) . Пороговое значение для экспрессии CD69 было основано на его экспрессии в неактивированных CD4 + Т-клетках, а экспрессия CD25 была установлена ​​на основе контура идентифицированных отрицательных и положительных популяций. Кратное изменение экспрессии CD69 и CD25 рассчитывали на основании экспрессии маркеров активации на клетках, активированных без P4 (клетки, активированные экспрессией, с P4 / клетки, активированные экспрессией, без P4). Все данные были проанализированы с помощью GraphPad Prism версии 8.0.1 (Сан-Диего, Калифорния, США).Большинство данных было нормально распределено и поэтому проанализировано с использованием одностороннего дисперсионного анализа с тестом множественного сравнения Даннета. Данные выражены в виде среднего значения и стандартного отклонения, а значения p ≤ 0,05 считались статистически значимыми.

Секвенирование РНК

РНК экстрагировали с помощью набора All Prep DNA / RNA Mini (Qiagen) в соответствии с протоколом, предоставленным производителем, и РНК элюировали 30 мкл воды, не содержащей РНКаз. Концентрацию РНК определяли с помощью спектрофотометра Nanodrop ® ND-1000 (Nanodrop Technologies Inc; Уилмингтон, Делавэр, США).Качество РНК контролировали с помощью набора Agilent RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) на приборе Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Числа целостности РНК (RIN) составляли 9,5 ± 0,4 (среднее ± стандартное отклонение). Библиотеки были сконструированы с использованием мРНК TruSeq Stranded (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США), которые были адаптированы для работы на роботе Agilent BRAVO (Agilent Technologies) с 440 нг мРНК в качестве исходного материала на образец. Вкратце, мРНК, содержащую поли-А, выделяли с использованием шариков, покрытых поли-dT, и разбивали на фрагменты из 150-400 пар оснований путем химической фрагментации и превращали в кДНК с помощью обратной транскриптазы и случайного праймера.Ферменты и более короткие фрагменты удаляли с использованием гранул AMPure XP (Beckman Coulter, Индианаполис, Индиана, США). Остальные фрагменты аденилировали с последующим лигированием индекс-адаптеров и амплифицировали с помощью ПЦР. Образцы кодировали штрих-кодом, объединяли и секвенировали на платформе Illumina NovaSeq 6000 с проточной ячейкой S1 и секвенировали PE2 × 101 п.н. В среднем 48,9 миллиона считываний было получено на образец (48,9 × 10 6 ± 10,5 × 10 6 , среднее ± стандартное отклонение). Файлы базового вызова за цикл (BCL) были демультиплексированы и преобразованы в FASTQ с помощью bcl2fastq v2.19.1.403 из программного пакета CASAVA (Illumina). Подготовка библиотеки и секвенирование проводились в Национальной инфраструктуре геномики, лаборатории науки для жизни, Стокгольм. Для РНК-секвенирования использовали парные образцы от восьми человек (всего n = 38 образцов).

Анализ данных RNA-seq

Файлы FASTQ были обработаны с помощью TrimGalore! для удаления загрязнений адаптера и обрезки некачественных участков. Считывания с парных концов были сопоставлены и сопоставлены с ансамблем эталонного генома человека GRCh47 (Genome Reference Consortium Human Build 37) с использованием STAR (версия 2.5.3.а). 79 Счетчики чтения генов были получены с помощью StringTie (версия 1.3.3). 80 Данные обрабатывались в R Studio (версия 1.1.456; Бостон, Массачусетс, США) с использованием пакетов edgeR 81, 82 и limma. 83, 84 Картированные считывания были отфильтрованы для генов с низкой экспрессией (сохранялись гены со счетами на миллион (имп / мин)> 1 по крайней мере в 3-х повторах) и использованы для дальнейшего анализа. Количество отфильтрованных генов нормализовали с использованием усеченного среднего M-значений (TMM) через calcNormFactors в edgeR.Преобразование Voom применяли до анализа дифференциальной экспрессии. FDR (Benjamini-Hochberg) 0,05 использовался в качестве порогового значения для DEG. Дифференциальную экспрессию, индуцированную P4, рассчитывали, сравнивая CD4 + Т-клетки, активированные в присутствии или в отсутствие P4. Резюме анализа данных RNA-seq можно увидеть в Supplementary Fig. 3 .

Путь, анализ обогащения набора генов и перекрытие генов

Для изучения биологической значимости DEG, анализ обогащения набора генов (GSE) с использованием gseKEGG и анализ пути с использованием enrich KEGG от Clusterprofiler 85 на основе Киотского протокола Энциклопедия генов и геномов (KEGG) 86, 87 .Для анализа GSE в качестве входных данных использовался предварительно ранжированный список индуцированных P4 DEG (на основе logFoldChange (logFC), n = 3339 генов через 6 часов и n = 3725 генов через 24 часа), где гены, у которых отсутствовал идентификатор гена Entrez. были удалены перед анализом. Оценка обогащения (ES) была рассчитана для всех наборов генов и нормализована для размера набора генов (нормализованная оценка обогащения; NES) по среднему распределению 1000 пермутаций. Минимальный размер набора генов был установлен на 20, а максимальный — на 200 генов, тем самым исключая малые и очень большие наборы общих данных.Скорректированное значение p ≤ 0,05 (по Бенджамини-Хохбергу) считалось статистически значимым. Перекрытие генов между различными наборами генов было выполнено с использованием пакета GeneOverlap в R (версия 4.0). 88

Измерение секретируемых белков в супернатантах культур с помощью анализа Proximity Extension Assay Для проверки центральных транскриптомных изменений на уровне белка супернатанты культур, собранные через 6-24-72 часа, анализировали на 92 белка, связанных с воспалением (панель Olink по воспалению. ; https: // www.olink.com/products/inflampting/) с мультиплексным ПЭА в центре клинических биомаркеров, Лаборатория науки для жизни, Университет Упсалы, SE-751 85 Упсала. Вкратце, 1 мкл клеточного супернатанта инкубировали с подобранными парами антител, связанных с уникальным олигонуклеотидом (бесконтактные зонды), специфичным для каждого биомаркера, который необходимо измерить. Близкое расположение зондов, связанных с их мишенями, приводит к гибридизации, которая с добавлением ДНК-полимеразы удлиняет олигонуклеотиды, создавая ДНК-ампликон, который можно обнаружить и количественно оценить с помощью количественной ПЦР в реальном времени. 37 Четыре внутренних контроля были включены для контроля качества и для нормализации данных. Данные были выражены как нормализованная экспрессия белка (NPX), произвольная единица в шкале log 2 . Значения ниже предела обнаружения были присвоены половине значения самого низкого предела обнаружения. Белки, которые были обнаружены не менее чем в 50% образцов в каждый момент времени, были включены в статистический анализ со следующими исключениями: CCL20 (40% обнаруживается через 24 часа), TGF-β1 (40% обнаруживается через 72 часа) и LIF. (47% через 24 часа), где более половины образцов в группе только активации было обнаружено (8-10 из 10) и значительно выше, чем неактивированные образцы (дополнительная таблица 2) .Статистические различия были определены с использованием теста Фридмана и Банджамини-Хохберга для корректировки множественных сравнений. Скорректированное значение p ≤0,05 считалось статистически значимым. Все данные были проанализированы с помощью GraphPad Prism версии 8.0.1.

Обогащенный анализ генов, ассоциированных с заболеванием

Гены, ассоциированные с заболеванием, для Хашимото (n = 141), болезни Грейвса (n = 245), MS (n = 801), псориаза (n = 580), RA (n = 1273), SLE (n = 817) и SS (n =) были получены из DisGeNET. 38 Все гены болезни, которые не присутствовали в фоновом режиме (все гены, обнаруженные с помощью RNAseq, n = 14363), были исключены из последующего анализа.Обогащающий анализ генов, связанных с заболеванием, среди генов, затронутых P4, был выполнен с использованием GeneOverlap in R, который использует точный тест Фишера для вычисления значений p и отношения шансов для перекрытий. 88 Р4-индуцированные DEG, которые использовались, включали уникально экспрессируемые гены, комбинирующие DEP как за 6, так и за 24 часа (всего n = 2563 гена с пониженной регуляцией и n = 2403 гена с повышенной регуляцией).

Взаимодействия TF-мишени

Взаимодействия TF-мишени были получены с использованием TRRUST 40 и DoRothEA 41 .Общее количество взаимодействий из TTRUST составило 9396, а из DoRothEA (включая взаимодействия с доверительной оценкой A и B) — 6620, но ограничение взаимодействий TF, на которые значительно повлиял P4, привело к общему количеству 3124 взаимодействий, сочетающих TTRUST и DoRothEA. . Сначала мы идентифицировали TF, на которые значительно влиял P4, а затем включили только те взаимодействия TF-мишени, где мишень также значительно подавлялась P4 и ассоциировалась с заболеванием, как установлено общими генами между всеми заболеваниями или между MS, псориазом и RA.Обогащение мишеней для STAT1 и STAT3 вычислялось с использованием точного теста Фишера, в котором мишени среди связанных с заболеванием генов, которые были подавлены P4, сравнивались с мишенями соответствующих TF среди всех генов, подавляемых P4. Для анализа TF-мРНК-белка мы объединили DEP, полученные при измерении экспрессии 92 белков, связанных с воспалением, в супернатантах культур через 6-24-72 часа (n = 41). Эти белки были сопоставлены с соответствующей мРНК и, в более широком смысле, с известными взаимодействующими ТФ.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ

Данные будут депонированы на GEO после публикации.

ВКЛАД АВТОРА

SH, JR и GP собрали образцы и провели эксперименты с культурами клеток и проточную цитометрию. SH, OR и RM выполнили предварительную обработку, анализ данных секвенирования РНК и биоинформатический анализ. JE, MG и MCJ внесли свой вклад в дизайн исследования и общее руководство исследованием. SH отвечал за подготовку рисунков и написание рукописи при поддержке MG, JE и MCJ.Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают благодарность Национальной инфраструктуре геномики (NGI) в Стокгольме, финансируемой лабораторией Science for Life, Фондом Кнута и Алисы Валленберг и Шведским исследовательским советом, а также Многопрофильным центром передовых вычислений SNIC / Упсалы за помощь параллельное упорядочение и доступ к вычислительной инфраструктуре UPPMAX.Авторы также хотели бы поблагодарить Центр клинических биомаркеров SciLifeLab в Швеции за помощь в анализе белков.

Прогестерон подавляет иммунные ответы в CD4 + T-клетках, активированных in vitro, и влияет на гены, связанные с аутоиммунными заболеваниями, которые улучшаются во время беременности

DOI: 10.3389 / fimmu.2021.672168. Электронная коллекция 2021 г.

Принадлежности Расширять

Принадлежности

  • 1 Биоинформатика, факультет физики, химии и биологии, Университет Линчёпинга, Линчёпинг, Швеция.
  • 2 Отделение воспалений и инфекций, Департамент биомедицинских и клинических наук, Университет Линчёпинга, Линчёпинг, Швеция.
  • 3 Отделение клинической иммунологии и трансфузионной медицины и Отделение биомедицинских и клинических наук, Университет Линчёпинга, Линчёпинг, Швеция.
Бесплатная статья PMC

Элемент в буфере обмена

Сандра Хеллберг и др. Фронт Иммунол..

Бесплатная статья PMC Показать детали Показать варианты

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

DOI: 10.3389 / fimmu.2021.672168. Электронная коллекция 2021 г.

Принадлежности

  • 1 Биоинформатика, факультет физики, химии и биологии, Университет Линчёпинга, Линчёпинг, Швеция.
  • 2 Отделение воспалений и инфекций, Департамент биомедицинских и клинических наук, Университет Линчёпинга, Линчёпинг, Швеция.
  • 3 Отделение клинической иммунологии и трансфузионной медицины и Отделение биомедицинских и клинических наук, Университет Линчёпинга, Линчёпинг, Швеция.

Элемент в буфере обмена

Полнотекстовые ссылки Опции CiteDisplay

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Изменения уровня прогестерона (P4) во время и после беременности совпадают с временным улучшением и ухудшением некоторых аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз (РС) и ревматоидный артрит (РА).Скорее всего, иммунно-эндокринные взаимодействия играют основную роль в этих эффектах, вызванных беременностью. В этом исследовании мы использовали секвенирование следующего поколения, чтобы изучить прямое влияние P4 на активацию CD4 + Т-клеток, ключевое событие при беременности и заболеваниях. Мы сообщаем о глубоком подавляющем воздействии P4 на активацию Т-клеток, изменяя профиль экспрессии генов и белков и обращая вспять многие изменения, вызванные во время активации. Транскриптомные изменения, индуцированные P4, были значительно обогащены генами, связанными с заболеваниями, которые, как известно, модулируются во время беременности, такими как MS, RA и псориаз.STAT1 и STAT3 были значительно подавлены P4, и их нижележащие мишени были значительно обогащены генами, связанными с заболеванием. Некоторые из этих генов включали хорошо известные и относящиеся к заболеванию цитокины, такие как IL-12β, CXCL10 и OSM, которые были дополнительно проверены также на уровне белка с использованием анализа расширения близости. Наши результаты расширяют предыдущие знания о P4 как о гормоне, регулирующем иммунную систему, и подтверждают его важность во время беременности для регулирования потенциально пагубных иммунных реакций на полуаллогенный плод.Кроме того, наши результаты также указывают на потенциальную роль P4 в иммуномодуляции заболеваний, вызванных беременностью, и подчеркивают необходимость дальнейших исследований, оценивающих P4 как вариант лечения в будущем.

Ключевые слова: CD4 + Т-клетки; Активация Т-клеток; прогестерон; профилирование белков; транскриптомика.

Авторские права © 2021 Hellberg, Raffetseder, Rundquist, Magnusson, Papapavlou, Jenmalm, Ernerudh and Gustafsson.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Цифры

Рисунок 1

Прогестерон подавляет активацию Т-клеток…

Рисунок 1

Прогестерон подавляет активацию Т-клеток и вызывает транскриптомные изменения в активированных CD4 +…

фигура 1

Прогестерон подавляет активацию Т-клеток и вызывает транскриптомные изменения в активированных Т-клетках CD4 + . (A) Первичные человеческие CD4 + Т-клетки были выделены из здоровых небеременных женщин (n = 13) и предварительно инкубированы с или без различных концентраций (10, 30 и 50 мкМ) P4 в течение 20 часов, а затем культивированные неактивированные или активированные in vitro со связанными с планшетом анти-CD3 и анти-CD28 антителами в присутствии или в отсутствие P4 в течение 6-24-72 часов. Образцы, культивированные в течение 72 часов, использовали только для измерения секретируемых белков. Влияние Р4 на активацию Т-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии, секвенирования РНК и анализа близости секретируемых белков в супернатантах культур. (B – D) Влияние P4 на маркеры активации Т-клеток CD69 (6 и 24 часа) и CD25 (только 24 часа) анализировали с помощью проточной цитометрии (n = 11-13). Гистограммы показывают процентное содержание Т-клеток CD4 + , экспрессирующих маркеры активации Т-клеток. Показано среднее ± стандартное отклонение. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001. (E, F) Анализ многомерного масштабирования данных экспрессии генов, полученных с помощью РНК-секвенирования (n = 3 неактивированных, n = 8 активированных с 50 мкМ P4 и без них).Группы выделяются цветом фона только для схематических целей. (G, H) Volcano графики транскриптомного анализа дифференциально экспрессируемых генов в Т-клетках CD4 + , активированных в присутствии P4, по сравнению с отсутствием P4. Черные точки FDR ≤ 0,05. P4, прогестерон.

Рисунок 2

Прогестерон подавляет иммунные пути…

Рисунок 2

Прогестерон подавляет иммунные пути активации Т-клеток CD4 + . (А,…

фигура 2

Прогестерон подавляет иммунные пути активации Т-клеток CD4 + . (A, B) Гистограммы, показывающие нормализованную оценку обогащения на оси x из анализа обогащения набора генов KEGG генов ответа P4 (DEG сравнивают активацию в присутствии P4 по сравнению с активацией отдельно) на 6 и 24 часов Все пути имеют скорректированное значение p FDR <0.05. (C, D) Диаграммы Венна перекрывающихся DEG между активируемыми и подавляющими генами в Т-клетках, активированных в присутствии или в отсутствие 50 мкМ P4. n = 3 неактивировано, n = 8 активировано с 50 мкМ P4 и без него. ДЭГ, дифференциально экспрессируемые гены: OR — отношение шансов; P4, прогестерон.

Рисунок 3

P4 значительно подавляет экспрессию белка…

Рисунок 3

P4 значительно подавляет экспрессию белка в супернатантах культур.Панель белков, связанных с воспалением…

Рисунок 3

P4 значительно подавляет экспрессию белка в супернатантах культур. Панель белков, связанных с воспалением, измеряли в супернатантах, собранных из CD4 + Т-клеток, которые были культивированы неактивированными или активированными с использованием или без 50 мкМ P4 (n = 9 в течение 6 часов, n = 10 в течение 24 часов и n = 10 в течение 72 часов). (A) Volcano графики дифференциально экспрессируемых белков (DEP) через 6, 24 и 72 часа, сравнивающие активацию в присутствии или в отсутствие P4.DEP определяли с помощью теста Фридмана и Бенджамини-Хохберга. Данные представлены как разница в нормированных значениях экспрессии белка (NPX), предоставленных производителем. Синие точки DEP регулируются с понижением P4, красные точки активизируют DEP и серые точки FDR ≤ 0,05. (B – D) Тепловые карты дифференциально экспрессируемых белков, сравнивающие активацию в присутствии P4 и только активацию. ns представляют собой белки, которые существенно не различались между активацией и неактивированными.Медианные значения NPX показаны на рисунке. нс, незначительно. (E) Диаграмма Венна, показывающая количество уникальных и общих DEP между различными моментами времени.

Рисунок 4

Прогестерон подавляет гены, связанные с заболеванием, на…

Рисунок 4

Прогестерон подавляет гены, связанные с заболеванием, для некоторых аутоиммунных заболеваний, в частности, через STAT1 и STAT3.…

Рисунок 4

Прогестерон подавляет гены, связанные с заболеванием, для некоторых аутоиммунных заболеваний, в частности, через STAT1 и STAT3. Влияние P4 на гены, связанные с заболеванием, и вышестоящие факторы транскрипции исследовали с использованием известных генов болезни (полученных из DisGeNET), а взаимодействия TF-мишени были основаны на TRRUST и DoRothEA. (A) Обогащение генов, связанных с заболеванием, для семи аутоиммунных заболеваний среди дифференциально экспрессируемых генов с помощью P4.DEG с пониженной регулировкой = синие столбцы, DEG с повышенным уровнем = красные столбцы. ДЭГ определяли, сравнивая клетки, активированные в присутствии Р4, с активацией отдельно, и представляли общее количество уникально экспрессируемых генов через 6 и 24 часа вместе. Пунктирная линия показывает p = 0,05. Гены, которые являются общими для всех семи заболеваний среди генов, дифференциально подавляемых с помощью P4, показаны над полосами. Значения p обогащения рассчитывали с помощью точного критерия Фишера. ТФ с наибольшим количеством взаимодействующих генов среди ассоциированных с заболеванием дифференциально подавляемых генов для (B) общих генов между семью различными заболеваниями (из 36 общих генов) и (C) общих генов между MS, RA и псориаз (всего из 57 ТФ). (D, E) Схематическое изображение STAT1 и STAT3 и их взаимодействующих генов. STAT1 и STAT3 значительно подавляются P4, как и их цели, изображенные на рисунке. ДЭГ, дифференциально экспрессируемые гены; РС; рассеянный склероз; Р4, прогестерон; РА, ревматоидный артрит; ТФ, фактор транскрипции.

Рекомендации

    1. Шумахер А, Коста С.Д., Зенклассен А.С.Эндокринные факторы, модулирующие иммунные ответы при беременности. Фронт Иммунол (2014) 5: 196. 10.3389 / fimmu.2014.00196 — DOI — ЧВК — PubMed
    1. Наир Р.Р., Верма П., Сингх К.Иммуно-эндокринные перекрестные помехи во время беременности. Gen Comp Endocrinol (2017) 242: 18–23. 10.1016 / j.ygcen.2016.03.003 — DOI — PubMed
    1. Лабарта Э., Мариани Дж., Хольтманн Н., Селада П., Ремохи Дж., Бош Э.Низкий уровень прогестерона в сыворотке в день переноса эмбриона связан с уменьшением продолжающейся беременности в циклах донорства ооцитов после подготовки искусственного эндометрия: проспективное исследование. Hum Reprod (2017) 32: 2437–42. 10.1093 / humrep / dex316 — DOI — PubMed
    1. Lydon JP, DeMayo FJ, Funk CR, Mani SK, Hughes AR, Montgomery CA Jr и др.. Мыши, лишенные рецептора прогестерона, демонстрируют плейотропные репродуктивные аномалии. Genes Dev (1995) 9: 2266–78. 10.1101 / gad.9.18.2266 — DOI — PubMed
    1. Мезиано С.Отзывчивость миометрия к прогестерону и контроль деторождения человека. Исследование J Soc Gynecol (2004) 11: 193–202. 10.1016 / j.jsgi.2003.12.004 — DOI — PubMed

Показать все 90 ссылок

LinkOut — дополнительные ресурсы

  • Полнотекстовые источники

  • Материалы исследований

  • Разное

HD обои: Модели, Сандра Хеллберг, Сандра Хеллберг

HD обои: Модели, Сандра Хеллберг, Сандра Хеллберг | Обои Flare Модели, Сандра Хеллберг, Сандра Хеллберг, HD обои Информация об оригинальных обоях: Размер изображения: 1920x1200px Размер файла: 296.94 КБ WallpaperFlare — это открытая платформа, на которой пользователи могут делиться своими любимыми обоями. Загружая эти обои, вы соглашаетесь с нашими Условиями использования и Политикой конфиденциальности. Это изображение предназначено только для использования в качестве обоев рабочего стола. Если вы являетесь автором и обнаружите, что это изображение используется без вашего разрешения, сообщите DMCA, пожалуйста, свяжитесь с нами. Выберите разрешение и загрузите эти обои

Загрузите эти обои как настольные ПК и ноутбуки (включая разрешения 720P, 1080P, 2K, 4K, для обычных ПК и ноутбуков HP, Lenovo, Dell, Asus, Acer):

Загрузите эти обои как рабочий стол iMac:

iMac 21.5-дюймовый дисплей со светодиодной подсветкой:

1920×1080

Загрузите эти обои как рабочий стол MacBook:

MacBook Air 13 дюймов, MacBook Pro 15.4 «:

Полный размер — 1440×900

MacBook Pro 13,3-дюймовый дисплей Retina, MacBook Air 13,3-дюймовый дисплей Retina, MacBook Air 13,3 дюйма (2020, M1):

2560×1600

Загрузите эти обои как рабочий стол с двумя мониторами:

Скачать эти обои как рабочий стол с тройным монитором:

Скачать эти обои как рабочий стол для четырех мониторов:

Загрузите эти обои как рабочий стол iPhone или экран блокировки:

iPhone 2G, iPhone 3G, iPhone 3GS:

320 x 480

iPhone 4, iPhone 4s:

640 x 960

iPhone 5, iPhone 5s, iPhone 5c, iPhone SE:

640×1136

iPhone 6, iPhone 6s, iPhone 7, iPhone 8:

750×1334

iPhone 6 plus, iPhone 6s plus, iPhone 7 plus, iPhone 8 plus:

1242×2208

iPhone X, iPhone Xs, iPhone 11 Pro:

; 1125×2436

iPhone Xs Max, iPhone 11 Pro Max:

; 1242×2688

iPhone Xr, iPhone 11:

828×1792

iPhone 12 mini:

1080×2340

iPhone 12, iPhone 12 Pro:

1170×2532

iPhone 12 Pro Max:

; 1284×2778

Загрузите эти обои в качестве рабочего стола телефона Android или экрана блокировки (для обычных телефонов Samsung, Huawei, Xiaomi, Oppo, Oneplus, Vivo, Tecno, Lenovo с Android):

Загрузите эти обои как рабочий стол iPad или экран блокировки:

iPad, iPad 2, iPad Mini:

768×1024, 1024×768

iPad 3, iPad 4, iPad Air, iPad Air 2, iPad 2017, iPad Mini 2, iPad Mini 3, iPad Mini 4, 9.IPad Pro, 7 дюймов:

2048×1536, 1536×2048

iPad Pro 10,5 дюйма:

2224×1668, 1668×2224

iPad Pro 11 дюймов:

2388×1668, 1668×2388

iPad Pro 12,9 дюйма:

2732×2048, 2048×2732

iPad Air 10,9 дюйма:

2360×1640, 1640×2360

iPad 10,2 дюйма:

2160×1620, 1620×2160

Загрузите эти обои в качестве рабочего стола или экрана блокировки планшетов Surface и Android:

Похожие обои HD

  • 1920 г. Икс 1080 px

    Сандра Хеллберг, голубые глаза, ноги, женщины на улице, браслеты
  • 2560 Икс 1600 px

    фэшн, Сандра Хеллберг, женщины, модель, брюнетка, длинные волосы
  • 1920 г. Икс 1200 px

    Sandra Bullock Widescreen, черное кружевное платье с длинным рукавом, знаменитость
  • 1106 Икс 1080 px

    Сандра Буллок, актриса, лицо, портрет, модель, выстрел в голову, 1 человек
  • 1920 г. Икс 1200 px

    волк, модели, сандра, женщины
  • 2000 г. Икс 1334 px

    женский коричневый свитер с высоким воротом, женская укладка листьев, модель
  • 2560 Икс 1600 px

    женщина в блузке с длинными рукавами, синих джинсовых шортах и ​​коричневой ковбойской шляпе
  • 3143 Икс 2000 г. px

    женское зимнее пальто коричневого цвета, Модель, Style, Fashion, Glamour, Sandra Hellberg
  • 2048 Икс 1365 px

    мышцы, поза, женский пол, мисс фитнес, сандра грахалес ромеро
  • 1920 г. Икс 1080 px

    Сандра Баллок Фон, знаменитость, знаменитости, голливуд
  • 2500 Икс 1667 px

    девушки, портрет, блондинка, лицо, модель, голые плечи, Сандра Кубицка
  • 1920 г. Икс 1440 px

    Сандра Буллок
  • 1889 г. Икс 1500 px

    актриса, вол, сандра, женщины
  • 6720 Икс 4200 px

    красота, девушка, модель
  • 1920 г. Икс 1200 px

    Сандра Баллок, знаменитость, знаменитости, голливуд
  • 2700 Икс 2225 px

    женская белая рубашка с воротником, глаза, взгляд, лицо, модель, волосы, красивая
  • 1920 г. Икс 1080 px

    Сандра Баллок Гравити, знаменитости, голливуд
  • 1920 г. Икс 1080 px

    Бодибилдер, женщины, модель, фитнес-модель, блондинка, мышцы
  • 1881 г. Икс 1500 px

    актриса, вол, сандра, женщины
  • 1920 г. Икс 1200 px

    Сандра Баллок 01
  • 1920 г. Икс 1080 px

    женский черный халтер, улыбка, лицо, модель, брюнетка, Sandra Kubicka
  • 1680 Икс 2520 px

    женщины, хвостик, Сандра Кубицка, женщины на открытом воздухе, улыбается, модель
  • 1920 г. Икс 1200 px

    Сандра Буллок
  • 1280 Икс 800 px

    Сандра Буллок, высокое разрешение, 2014, знаменитости, голливуд
  • 2000 г. Икс 1114 px

    Модели, Лана Роудс
  • 1280 Икс 800 px

    Sandra Bullock 2014 Full, женский белый топ на тонких бретелях, знаменитость
  • 2188 Икс 1080 px

    черно-синий мотоцикл чоппер, сандра домбровская, байк, стиль
  • 1920 г. Икс 1200 px

    Сандра Буллок, актриса, женщины, брюнетка, платье в сеточку, смотрит на зрителя
  • 2000 г. Икс 1319 px

    Модели, Лана Роудс, Женщина
  • 1920 г. Икс 1196 px

    Модели, Анджела Уайт, Женщина, женщины, сидя, мебель, один человек
  • 1920 г. Икс 1200 px

    Актрисы, Сандра Буллок
  • 2560 Икс 1440 px

    женское красно-синее платье с этническим принтом, модель, вода, азиатка
  • 1992 г. Икс 1147 px

    Модели, Лия Готти, Женщина
  • 1800 Икс 1200 px

    Галь Гадот, фитнес-модель, израильтяне, актриса, женщины
  • 1920 г. Икс 1200 px

    Сандра Баллок Высокое качество, знаменитости, знаменитости, голливуд
  • 2500 Икс 1667 px

    глаза, взгляд, девушка, модель, волосы, браслеты, Sandra Kubicka
  • 1920 г. Икс 1200 px

    Sandra Bullock Фото, женское черное сетчатое длинное платье с коротким рукавом
  • 1920 г. Икс 1080 px

    Фильм, Предложение, Райан Рейнольдс, Сандра Буллок
  • 2560 Икс 1600 px

    Сандра Баллок Gravity Desktop, гравитационный фильм, знаменитость, знаменитости
  • 1920 г. Икс 1079 px

    Сандра Насич, блондинка, светлые волосы, певица, молодой человек, 1 человек
  • 1600 Икс 1177 px

    Актрисы, Сандра Буллок
  • 1920 г. Икс 1080 px

    женский синий топ, модель, длинные волосы, брюнетка, зеленые глаза, портрет
  • 1920 г. Икс 1200 px

    Сандра Баллок 2014 Фон, знаменитость, знаменитости, голливуд
  • 1920 г. Икс 1200 px

    Сандра Баллок 2014 Высокое качество, знаменитости, знаменитости, голливуд
  • 1939 г. Икс 1500 px

    актриса, вол, сандра, женщины
  • 1920 г. Икс 1440 px

    Sandra Bullock High Definition, красный цветок гибискуса и белое женское платье без рукавов
  • 1920 г. Икс 1200 px

    женщины, блондинка, лицо, улыбается, женщины на открытом воздухе, смотрит на зрителя
  • 4256 Икс 2832 px

    актриса, детка, бхатия, Болливуд, модель, таманна
  • 1920 г. Икс 1080 px

    женский топ с короткими рукавами, Sandra Bullock, монохром, брюнетка
  • 1500 Икс 1080 px

    Сандра Буллок, монохромный, актриса, хвост, черные перчатки
Загрузка обоев

Адаптивная и врожденная иммунная реактивность к Borrelia burgdorferi sensu lato у детей с бессимптомным воздействием и детей с предшествующим клиническим заболеванием Лайм-боррелиозом. Научно-исследовательский документ по теме «Клиническая медицина»

Hindawi Publishing Corporation, клиническая иммунология и иммунология развития, том 2012, ID статьи 294587, 10 страниц doi: 10.1155/2012/294587

Исследовательская статья

Адаптивная и врожденная иммунная реактивность к Borrelia burgdorferi sensu lato у детей с бессимптомной экспозицией и детей с предшествующим клиническим заболеванием Лайм-боррелиозом

Барбро Х. Скогман, 1,2 Сандра Хеллберг, 3 Кристина Экерфельт, 3 Мария К. Дженмальм, 3 Пиа Форсберг, 4 Джонни Людвигссон, 5 Свен Бергстрём, 6 и Ян Эрнеруд4

1 педиатрическое отделение, больница общего профиля Фалунь, 791 82 Фалун, Швеция

2 Центр клинических исследований в Даларне, Ниссерс ваг 3, 791 82 Фалун, Швеция

3 Отдел клинической иммунологии, Департамент клинической и экспериментальной медицины, Университет Линчёпинга, 581 85 Линчёпинг, Швеция

4 Отделение инфекционных болезней, Департамент клинической и экспериментальной медицины, Университет Линчёпинга, 581 85 Линчёпинг, Швеция

5 Отделение педиатрии, Департамент клинической и экспериментальной медицины, Университет Линчёпинга, 581 85 Линчёпинг, Швеция

6 Кафедра молекулярной биологии, Университет Умео, 901 87 Умео, Швеция

Корреспонденция должна быть адресована Барбро Х.Скогман, [email protected] Поступила 7 июня 2011 г .; Пересмотрено 25 августа 2011 г .; Принята в печать 29 августа 2011 г. Академический редактор: Иоанна Зайковска

Авторские права © 2012 Барбро Х. Скогман и др. Это статья в открытом доступе, распространяемая по лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Почему у некоторых людей развиваются клинические проявления боррелиоза Лайма (БЛ), а у других симптомы остаются бессимптомными, в значительной степени неизвестно.Поэтому мы хотели изучить адаптивную и врожденную иммунную реакцию на Borrelia burgdorferi sensu lato у бессимптомных детей с положительным результатом на Borrelia-антитела (n = 20), детей с предыдущей клинической LB (n = 24) и контрольной группы (n = 20). Образцы крови анализировали на боррелий-специфический интерферон (IFN) -y, интерлейкин (IL) -4 и секрецию IL-17 с помощью ELISPOT и индуцированные боррелиями IL-1ß, IL-6, IL-10, IL-12 (p70 ) и секреция фактора некроза опухоли (TNF) Luminex. Мы не обнаружили существенных различий в секреции цитокинов между группами, но тенденция к повышенной спонтанной секреции IL-6 была обнаружена среди детей с предыдущей клинической LB.В заключение можно сказать, что адаптивная или врожденная иммунная реакция на Borrelia burgdorferi sensu lato была сходной у бессимптомных детей, подвергшихся воздействию Borrelia, и детей с предыдущей клинической формой LB. Таким образом, иммунологические механизмы, важные для эффективного уничтожения спирохет без развития клинических проявлений LB, остаются неизвестными.

1. Введение

Лайм-боррелиоз (ЛБ), вызываемый спирохетой Borrelia (B.) burgdorferi, является наиболее распространенной клещевой инфекцией как в Европе, так и в США [1, 2].Инфекция может вызывать различные симптомы, поражая различные органы, такие как кожа, суставы, сердечная мышца или нервная система. Наиболее частым проявлением ЛБ является мигрирующее красное поражение кожи, называемое мигрирующей эритемой (ЭМ). ЛБ у детей протекает несколько иначе, чем у взрослых, и продолжительность симптомов часто короче [3]. У детей прогноз лучше, чем у взрослых, и они реже сообщают о стойких симптомах [4-6].

Клетки врожденной иммунной системы, составляющие первую линию защиты, распознают патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP) через рецепторы распознавания паттернов (PRR), такие как Toll-подобные рецепторы (TLR) [7]., IL-6, IL-10 и IL-12, а также фактор некроза опухоли (TNF) из моноцитов, макрофагов, нейтрофилов и DC [9–12]. Эти цитокины важны для привлечения других компонентов врожденного иммунного ответа хозяина, а также для передачи сигналов с помощью адаптивного иммунитета

. Система

[12]. Адаптивная иммунная система состоит из Т- и В-лимфоцитов и составляет вторую линию защиты от спирохет. Активированные Т-хелперные (Th) клетки дифференцируются в Th2, Th3, Th27 или Т-регуляторные клетки [13].Клетки Th2 важны для иммунитета против внутриклеточных патогенов, тогда как клетки Th3 участвуют в иммунных ответах против внеклеточных паразитов [14]. Типичными эффекторными клетками Th2 и Th3 являются макрофаги и тучные клетки соответственно. Th2 и Th3 определяются их сигнатурными цитокинами IFN-y и IL-4, которые действуют антагонистически, уравновешивая друг друга. Клетки Th27, продуцирующие IL-17, участвуют в защите от грибов и некоторых внеклеточных бактерий [15]. Иммунный ответ на B.burgdorferi включает как гуморальные, так и клеточно-опосредованные иммунные ответы, где как независимые от Т-клеток, так и зависимые от В-клеток ответы важны во время адаптивного иммунного ответа для уничтожения спирохет [12].

Дети и взрослые различаются по типу иммунного ответа, который они вызывают при встрече с B. burgdorferi. У взрослых иммунный ответ на LB характеризуется сильным Th2-ответом с большим количеством боррелий-специфичных IFN-y-секретирующих клеток и низким уровнем IL-4 [16, 17], тогда как у детей, по-видимому, более сбалансированный иммунный ответ с повышенной секрецией как IFN-γ, так и IL-4 [18].Была выдвинута гипотеза, что тип иммунного ответа, вызванный в присутствии спирохет Borrelia, может иметь значительное влияние на клиническое течение и исход инфекции [19]. Стойкие симптомы после LB были связаны с сильным ответом IFN-γ, но отсутствовала последующая регуляция IL-4 [19]. Таким образом, представляется, что более поздний выраженный иммунный ответ Th3 необходим для подавления первоначального сильного ответа IFN-γ с целью эффективного прекращения инфекции и предотвращения неудовлетворительного повреждения тканей.Это может быть одним из возможных объяснений того, почему у детей обычно более благоприятное течение болезни, поскольку они демонстрируют сильные иммунные ответы Th2 и Th3 [18].

Тот факт, что некоторые люди могут подвергаться воздействию B. burgdorferi s.l. без развития клинических симптомов представляет интерес с иммунологической точки зрения и может указывать на более эффективный иммунный ответ на спирохеты у этих людей. У взрослых термин «бессимптомная инфекция Borrelia» используется для обозначения людей, подвергшихся воздействию B.burgdorferi s.l. (т.е. с антителами Borrelia IgG в сыворотке) без известных ранее клинических данных о LB [20]. Было обнаружено, что у этих бессимптомных лиц наблюдается более высокая секреция провоспалительных цитокинов IL-12 и TNF, чем у пациентов с клиническими проявлениями LB, что свидетельствует о повышенной врожденной активности [21]. Что касается адаптивных иммунных ответов, не было обнаружено различий в специфической для Borrelia секреции IFN-γ и IL-4 при сравнении бессимптомных взрослых, подвергшихся воздействию Borrelia, с пациентами с клинической LB [20].Насколько нам известно, врожденные и адаптивные иммунные ответы ранее не изучались у бессимптомных детей, подвергшихся воздействию Borrelia.

Целью этого исследования было изучить адаптивную и врожденную иммунную реакцию на бессимптомных детей, подвергшихся воздействию Borrelia, по сравнению с детьми с предыдущей клинической LB для выяснения иммунологических механизмов

, которые могут способствовать эффективному искоренению патогена.

2.Материалы и методы

Детей, набранных для участия в этом исследовании, первоначально были включены в более крупное проспективное исследование, исследование ABIS (Все дети в юго-восточной Швеции), с основной целью выявления факторов риска иммуноопосредованных заболеваний, в основном диабета 1 типа (n = 17 055). За этими детьми наблюдали до достижения 5-летнего возраста в центрах первичной медико-санитарной помощи. Все участвующие семьи заполнили утвержденную анкету, и образцы венозной или капиллярной крови были собраны вместе с 5-летним наблюдением.Две тысячи детей были случайным образом отобраны и проверены на антитела к Borrelia IgG в сыворотке [22]. Информация, касающаяся пола, географического положения, известных укусов клещей, предшествующей LB и лечения антибиотиками для LB, была собрана из анкеты.

Из этих 2000 детей было выбрано 64 географически распределенных ребенка, которые представляли три основные группы: бессимптомные дети, подвергшиеся воздействию Borrelia (n = 20), дети с предыдущей клинической LB (n = 24) и контрольная группа (n = 20) (таблица 1).Бессимптомные дети, подвергавшиеся воздействию Borrelia, характеризовались наличием в сыворотке антител IgG к Borrelia, но в анкете они не сообщили о предыдущих симптомах или лечении от LB. Дети с предыдущей клинической LB сообщили о предыдущем лечении LB, и у некоторых из них были антитела к Borrelia в сыворотке (4/24). Контрольная группа не сообщила об отсутствии симптомов или предшествующего лечения LB и не имела антител к Borrelia в сыворотке (таблица 1). Контрольная группа и дети с предыдущей клинической ЛБ были сопоставлены по полу и географическому положению с бессимптомными детьми, подвергавшимися воздействию боррелий (таблица 1).Все 64 ребенка были включены в анализ с помощью анализа ELISPOT, но некоторых позже пришлось исключить (n = 16) из-за низких ответов в положительном контроле (см. Обработка данных). Эти исключенные дети не различались статистически по полу (женщины 7/16 против 22/48) или географическому положению (сельское проживание 7/16 против 19/48) по сравнению с включенными детьми (n = 48). Образцы от 41 ребенка были использованы для анализа с помощью Luminex из-за недостаточности образцов клеток (см. Обработка данных). Исключенные дети (n = 23) не различались статистически по полу (женщины 10/23 против 19/41) или географическому положению (сельское проживание 10/23 против 16/41) по сравнению с включенными детьми (n = 41).Информированное согласие было дано всеми участвующими семьями, и исследование было одобрено Региональным этическим комитетом факультета медицинских наук, Линчёпинг, Швеция (Dnr 03-547). Вся лабораторная работа в этом исследовании (то есть не сбор и криоконсервация клеток) была проведена одним человеком (С. Хеллберг, один из авторов).

2.1. ELISA-тест на антитела к B. burgdorferi s.l. Был использован коммерческий набор для иммуноферментного анализа (ELISA), основанный на боррелии-специфическом белке Flagellin (набор IDEA Borrelia burgdorferi IgG, DakoCytomation, Glostrup, Дания

).

Таблица 1: Характеристики субъектов в возрасте 5 лет.

Выявленные бессимптомные Предыдущие клинические контроли LB

(n = 20) (n = 24) (n = 20)

Пол (ж / м) 11/11/13 11/11

Сельская жизнь 7 11 8

Известные укусы клещей 20 24 0

Предыдущий клинический LB

EM 0 22 0

NB, паралич лицевого нерва 0 5 0

NB, менингит 0 1 0

Лечение антибиотиками при ЛБ 0 24 0

Антитела IgG к боррелиям в сыворотке крови * 20 4 0

Примечание.Данные, указанные в таблице, даны как количество детей. У некоторых детей с предыдущей клинической ЛБ появилось несколько симптомов. n: число; f: самка; м: самец; LB: боррелиоз Лайма; EM: мигрирующая эритема; NB: нейроборрелиоз; IgG: иммуноглобулин G * На основе набора ELISA (DAKO) для антител IgG к антигену жгутиков, специфичному для Borrelia [24].

и Oxoid Limited, Хэмпшир, Великобритания) [24], и пороговое значение для значений OD было установлено в соответствии с инструкциями производителя.

2.2. Выделение, криоконсервация и оттаивание мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Образцы крови были собраны в центрах первичной медико-санитарной помощи, отправлены в отделение педиатрии Университета Линчепинга и подготовлены для изоляции и криоконсервации, как описано в более ранних исследованиях [25]. Когда пришло время анализов, образцы вынули из контейнера с азотом и разморозили на водяной бане с температурой 37 ° C. После размораживания суспензию клеток немедленно переносили в полипропиленовую пробирку на 15 мл и предварительно нагретую (37 ° C) среду для культивирования тканей (TCM), содержащую 10% термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (FCS; Sigma Aldrich, Стокгольм, Швеция) и Iscove’s. модификация среды Дульбекко (GIBCO, Пейсли, Великобритания) с добавлением L-глутамина (Sigma Aldrich Sweden AB, Стокгольм, Швеция) 292 мг / л, MEM (минимальная необходимая среда) 100 X заменимых аминокислот 10 мкг / мл (Invitrogen AB , Пейсли, Великобритания), пенициллин 50 мкл-1, стрептомицин 50 мкг-1 (BioWhittaker Europe, Эссен, Германия) и NaHCO33.024 мкл-1 (Merck KGaA, Damstedt, Германия) добавляли по каплям вдоль стенки пробирки, чтобы избежать осмотического шока в клетках. Суспензию клеток центрифугировали в течение 10 минут при 400 мкг при комнатной температуре и супернатант отбрасывали. Клетки дважды промывали TCM при 400 мкг при комнатной температуре в течение 10 мин. Подсчет клеток проводили с помощью камеры Беркера в фазово-контрастном микроскопе (Carl Zeiss AB, Стокгольм, Швеция). Целостность клеточной мембраны, то есть жизнеспособность клеток, оценивалась с исключением трипанового синего и составляла от 83% до 99% со средним значением 95%.Концентрацию клеток доводили до 1 × 106 PBMCmL-1.

2.3. Получение антигена фракции, обогащенной белком внешней поверхности (OF) Borrelia. Клетки, как в анализе ELISPOT, так и при стимуляции in vitro для анализа Luminex, стимулировались OF, состоящим в основном из OspA и OspB из штамма Ip90 B. garinii. Этот антиген был выбран, потому что он имеет

Ранее было показано, что

эффективен для дифференциации людей с инфекциями Borrelia от контрольных в анализе ELISPOT на специфическую секрецию IFN-y и IL-4 Borrelia [17, 23].г / мл.

2.4. ELISPOT-анализ на IFN-γ, IL-4 и IL-17. Для определения Т-клеточного ответа на B. burgdorferi s.l. использовали анализ ELISPOT для оценки количества Borrelia-специфичных IFN-γ, IL-4- и IL-17-секретирующих клеток. Анализ ELISPOT, первоначально описанный Czerkinsky et al. [28], были выполнены в соответствии с инструкциями производителя (Mabtech AB, Nacka, Швеция) и как подробно описано в более ранних исследованиях [17, 23]. Столбнячный анатоксин (TT; Шведский институт по контролю за инфекционными заболеваниями, Стокгольм, Швеция) и фитогемагглютинин A (PHA; Sigma-Aldrich AB, Стокгольм, Швеция) использовали в качестве положительных контролей, представляющих антиген отзыва и поликлональную стимуляцию, соответственно, в конечной концентрации. 5 единиц LF мл-1 для TT и 20 мкг / мл для PHA.gmL-1. Что касается отрицательных контролей, лунки с TCM использовали без клеток. Все образцы (за исключением лунок, содержащих только PHA или только клеточную среду) анализировали в трех экземплярах, хотя некоторые образцы можно было анализировать только в двух экземплярах из-за низкого количества клеток. Пятна подсчитывали вручную с помощью диссекционного микроскопа и полуавтоматической системы AID EliSpot Reader / HR версии 3.2.3 (AID autoimmune Diagnostics GmbH, Strassberg, Германия) слепым способом за один раз тем же

.

человека (С., IL-6, IL-10, IL-12 (p70) и TNF измеряли в супернатантах PBMC с помощью набора Bio-Plex Pro Human Cytokine Panel Kit (Bio-Rad Laboratories, Калифорния, США). Все анализы проводились в соответствии с инструкциями производителя. Затем планшеты анализировали с помощью Luminex200 (Invitrogen, Merelbeke, Бельгия). Условия анализа были установлены как минимум 100 шариков на область. Исходные данные, средняя интенсивность флуоресценции (MFI), анализировали с помощью xPONENT 3.1 (Luminex Corporation, Остин, Техас, США).1,91-1959,31 пгмл-1, IL-6 1,54-25171 пгмл-1, IL-10 1,48-6076 пгмЛ-1, TNF 4,75-19438,75 пгмл-1 и для IL-12 (p70) 2,19-8988 пгмЛ-1. Значениям ниже самого низкого предела обнаружения стандартной кривой была присвоена половина значения предела обнаружения, а значениям выше наивысшего предела обнаружения были присвоены двойные значения предела обнаружения.

2.6. Обработка данных. Что касается анализа ELISPOT, для анализа цитокин-секретирующих клеток использовали медианное значение трех повторностей или дубликатов.Метод определения секреции, специфичной для Borrelia, в этом исследовании ранее применялся в других исследованиях [18-20] и основан как на нестимулированной, спонтанной секреции, так и на антиген-стимулированной секреции клеток. Специфическую секрецию Borrelia определяли путем вычитания количества пятен в лунках с клеточной суспензией и средой (т.е. спонтанной секреции) из числа пятен в лунках, стимулированных OF-антигеном (т.е. секреции, стимулированной Borrelia) [ 20].Как специфическая для боррелий секреция, так и спонтанная секреция интересно показать, чтобы дать полную картину иммунных ответов, и поэтому обе они представлены в результатах, обсуждениях и рисунках.

Все 64 образца были исследованы с помощью анализа ELISPOT. Однако, поскольку у некоторых положительных контролей были низкие ответы, были использованы определенные критерии, чтобы гарантировать, что клетки обладают способностью отвечать. Эти критерии в основном основывались на ответах PHA на IFN-γ. Все образцы с высоким ответом PHA на IFN-γ (более 300 точек) были включены (n = 27).Были включены образцы с ответом PHA 200-300 точек, если они также имели очевидный антиген-индуцированный ответ на TT и CEF (для более чем одного цитокина) или сильный ответ PHA на IL-4 и IL-17 (n = 19 ). Основываясь на предыдущем опыте, образцы с ответом PHA на IFN-y, показывающим менее 200 пятен, были исключены (n = 16)

, за исключением двух образцов, показывающих сильные антиген-индуцированные ответы как для TT, так и для CEF (более чем для двух цитокинов) и сильные ответы PHA как для IL-4, так и для IL-17 (n = 2).Все эти соображения были исключены из принадлежности к группам и секреции, стимулированной боррелиями.

Что касается анализа Luminex, был доступен 41 образец, и все они были проанализированы. Способность клеток реагировать на стимулы оценивали по соотношению между образцами, стимулированными LPS, и спонтанной секрецией. Образцы включались, если у них было соотношение ЛПС / спонтанная секреция пять или более для любого из проанализированных цитокинов. На основании этих критериев все образцы были действительными и могли быть включены в анализ (n = 41).Секрецию, индуцированную Borrelia, получали путем вычитания спонтанной секреции из образцов, стимулированных антигеном Borrelia OF, как это было ранее реализовано для анализа ELISPOT.

2.7. Статистический анализ. Статистические продукты и сервисные решения (SPSS) версии 17.0 для Windows использовались для статистического анализа. Тест Краскела-Уоллиса использовался в качестве предварительного теста для сравнения иммунологических параметров между группами. U-критерий Манна-Уитни использовался в качестве апостериорного теста, когда значение P для критерия Краскела-Уоллиса было P <0.08. Для Манна-Уитни уровень P <0,05 считался статистически значимым. Поскольку цитокины, проанализированные в этом исследовании, рассматривались как часть паттерна, а не как отдельные события, поправки на множественные сравнения не вносились.

3. Результаты

3.1. Количество клеток, секретирующих IFN-γ, IL-4 и IL-17, измеренное с помощью ELISPOT. Все группы продемонстрировали преобладание Borrelia-специфичных IFN-γ-секретирующих клеток по сравнению с IL-4- и IL-17-секретирующими клетками.Однако не было обнаружено значительных различий между бессимптомными детьми, подвергавшимися воздействию Borrelia, и детьми с предыдущей клинической LB в отношении количества Borrelia-специфичных IFN-, IL-4- и IL-17-секретирующих клеток (Рисунок 1). Более того, не было обнаружено значительных различий по сравнению с контрольной группой ни для одного из проанализированных цитокинов. Некоторые люди во всех трех группах имели отрицательные значения секреции, специфичной для Borrelia, то есть спонтанная секреция была выше, чем секреция, стимулированная OF (рис. 1).

При анализе количества спонтанно секретирующих клеток, указывающих на нестимулированную фоновую активность секреции цитокинов, нет значимых различий в IFN-y, IL-

.

4 или IL-17 был обнаружен между любой из групп (рис. 2). Соотношение между количеством спонтанно секретирующих IL-4 и IFN-γ клеток, оценивающее баланс Th3 / Th2, не показало каких-либо значительных различий между группами (данные не показаны). ФГА-индуцированная секреция, указывающая на способность клеток реагировать на митогенную стимуляцию, вызвала более сильный ответ на IFN-γ, чем на IL-4 и IL-17, но не было обнаружено различий между группами (данные не показаны)., IL-6, IL-10 и TNF были легко обнаружены с помощью

Таблица 2: OF индуцировала секрецию цитокинов в PBMC с помощью Luminex.

Цитокин, экспонированный бессимптомно Предыдущие клинические контроли LB

l-lß 309 (183-846) 341 (132-1223) 340 (162-800)

Ил-6 6805 (3528-12749) 7304 (3281-50303) 7335 (2578-12324)

л-10 130 (38-442) 129 (42-572) 123 (37-684)

lL-l2 (p70) 1 (0-1) 1 (0-1) 1 (0-1)

TNF 676 (241-2311) 561 (209-1724) 628 (226-1373)

ПРИМЕЧАНИЕ.Данные, указанные в таблице, представлены как медианные значения в пг / мл (диапазон в скобках).

OF: фракция, обогащенная белком внешней поверхности; PBMC: мононуклеарные клетки периферической крови; LB: Лайм-боррелиоз; IL = интерлейкин; TNF: фактор некроза опухоли.

S S 20 —

Ты тт и-в

Выявленные бессимптомные Предыдущие клинические контрольные группы LB (n = 17) (n = 17) (n = 14)

Выявленные бессимптомные Предыдущие клинические контроли LB

(n = 17) (n = 17) (n = 14)

Рисунок 1: Количество Borrelia-специфичных IFN-γ-секретирующих клеток (белый кружок), IL-4-секретирующих клеток (незаштрихованный квадрат) и IL-17-секретирующих клеток (белый треугольник), на 100000 PBMC по данным ELISPOT. в разных группах.Заштрихованные кружки, квадраты и треугольники представляют детей из предыдущей клинической группы LB с серопозитивностью Borrelia. Секреции, специфичные для Borrelia, представляют собой чистые значения, полученные после вычитания количества спонтанно секретирующих цитокин клеток из количества антиген-специфических цитокин-секретирующих клеток фракции белка внешней поверхности (OF-). Средние значения отмечены на рисунке линиями. Статистически значимых различий между группами не обнаружено.

Luminex, тогда как секреция IL-12 (p70), индуцированная Borrelia, не обнаруживалась во всех образцах (таблица 2).Более того, уровни IL-12 (p70) также были ниже предела обнаружения также в 32 из 40 образцов, стимулированных LPS, и не превышали 8 пг / мл в остальных 8 образцах. Таким образом, уровни IL-12 (p70) не считались интерпретируемыми. Из оставшихся цитокинов IL-6 присутствовал в самой высокой концентрации во всех группах, а IL-10 — в самой низкой концентрации во всех группах (таблица 2).

Что касается секреции, вызванной боррелиями, не было обнаружено значительных различий между бессимптомными детьми, подвергавшимися воздействию Borrelia, детьми с предыдущей клинической LB и контрольной группой в отношении IL-1, IL-6, IL-10 и TNF (рис. 3).Спонтанная секреция существенно не различалась между

.

Рисунок 2: Количество спонтанно секретирующих IFN-γ клеток (белый кружок), IL-4-секретирующих клеток (незаштрихованный квадрат) и IL-17-секретирующих клеток (открытый треугольник) на 100000 PBMC, измеренное с помощью ELISPOT в разные группы. Заштрихованные кружки, квадраты и треугольники представляют детей из предыдущей клинической группы LB с серопозитивностью на Borrelia. Средние значения отмечены на рисунке линиями. Статистически значимых различий между группами не обнаружено.

группы для любого из цитокинов, хотя наблюдалась тенденция (P = 0,057) к повышенной спонтанной секреции IL-6 у детей с предшествующей клинической LB по сравнению с бессимптомными детьми, подвергавшимися воздействию Borrelia (рис. 4). Соотношение между секрецией, стимулированной ЛПС, и спонтанной секрецией, указывающее на способность клеток отвечать на стимул, агонистический по отношению к TLR4, составляло (средние значения с диапазоном в скобках): 301 (9-2051) для IL-1 # 314 ( 8-4262) для Ил-6; 134 (17-450) для IL-10 и 66 (7-652) для TNF (данные не показаны).

4. Обсуждение

В этом исследовании мы исследовали боррелии-специфические (адаптивные) и индуцированные боррелиями (врожденные) иммунные ответы у бессимптомных детей, подвергшихся воздействию боррелий, и детей с

1500 -,

1250–

1000 Л 750 —

DnDD ° □ □□

□ □

Выявлено бессимптомно Предыдущее

(n = 15)

клинических ЛБ (n = 12)

•••

▲ ▲

Контрольные (n = 14)

-1-1-1-

Выявленные бессимптомные Предыдущие контроли

(n = 15) клиническая LB (n = 14)

(n = 12)

50000 20000 20000

Ил-6 □ □

□□□ □ пП

Выявлено бессимптомно (n = 15)

Предыдущая клиническая LB (n = 12)

□ □

Выявлено бессимптомно (n = 15)

Предыдущая клиническая LB (n = 12)

А А А А А

Контрольные (n = 14)

Контрольные (n = 14)

Рисунок 3: Вызванная боррелиями секреция IL-1j8, IL-6, IL-10 и TNF в супернатантах PBMC от бессимптомных детей, подвергшихся воздействию Borrelia (закрашенный кружок), детей с предыдущими клиническими LB (незаполненный квадрат) и контрольной группы ( закрашенный треугольник) согласно измерениям Luminex.Секреция, индуцированная Borrelia, представляет собой чистые значения, полученные после вычитания уровня спонтанной секреции цитокинов из уровня секреции цитокинов, стимулированной фракцией белка внешней поверхности (OF-). Средние значения отмечены на рисунке линиями. Статистически значимых различий между группами не обнаружено.

предыдущий клинический LB. Наша цель состояла в том, чтобы лучше понять иммунологические механизмы, которые могли бы объяснить, почему у некоторых людей развиваются клинические проявления LB, а у других — нет.Интересно, что мы не обнаружили различий в количестве Borrelia-специфичных IFN-γ, IL-4- и IL-17-секретирующих клеток при сравнении бессимптомных детей, подвергшихся воздействию Borrelia, детей с предыдущей клинической LB и контрольной группы. Этот недостаток специфической (адаптивной) иммунной реактивности Borrelia согласуется с более ранними исследованиями бессимптомных взрослых, подвергавшихся воздействию Borrelia, где не было обнаружено различий в количестве клеток, специфичных для Borrelia, по сравнению с пациентами с клиническим LB [ 20]. Наши отрицательные результаты подтверждаются Jarefors et al., Секреция IL-6, IL-10 или TNF между группами была обнаружена в нашем исследовании, тогда как в предыдущем исследовании Sjowall et al. [21], у бессимптомных взрослых было обнаружено повышенное количество вызванных боррелиями TNF-секретирующих ДК по сравнению с пациентами с НБ в анамнезе [21].

Нам хорошо известно, что количество пациентов в каждой группе невелико; но с хорошо охарактеризованными группами пациентов, надлежащим дизайном исследования и непараметрическими статистическими расчетами результаты должны быть надежными.Более того, тот факт, что количество специфичных для Borrelia клеток, секретирующих IFN-γ и IL-4, было в целом ниже по сравнению с более ранними исследованиями [17, 18, 20], заставил нас считать, что реакция клеток на стимулы может были снижены из-за качества клеток после замораживания (предыдущие исследования проводились на свежеизолированных клетках).

50 — | 35 —

20 -120 -r

Ил-1ß

□ □

□ □□□□

▲ AA

Выявлено бессимптомно Предыдущее

(n = 15)

клинических ЛБ (n = 12)

Ил-10 □

Контрольные (n = 14)

• ••

— »» * —

Выявленные бессимптомные Предыдущие контроли

(n = 15) клиническая LB (n = 14)

(n = 12)

P = 0.057 I-1

pddydd

Выявлено бессимптомно Предыдущая (n 15) клиническая LB

(n = 12)

Контрольные (n = 14)

«это» AA

Выявленные бессимптомные Предыдущие контроли

(n = 15) клиническая LB (n = 14)

(n = 12)

Рисунок 4: Спонтанная секреция IL-1j8, IL-6, IL-10 и TNF в супернатантах PBMC от Borrelia, бессимптомных детей (закрашенный кружок), детей с предыдущей клинической LB (белый квадрат) и контрольной группы (закрашенный треугольник) ) согласно измерениям Luminex.Средние значения отмечены на рисунке линиями. Наблюдалась тенденция к более высокому уровню IL-6 у детей с предыдущей клинической LB по сравнению с бессимптомными детьми, подвергавшимися воздействию Borrelia, в остальном статистически значимых различий между группами не было обнаружено.

Однако ответ на PHA был аналогичен полученному в другом исследовании LB у взрослых [17], и, кроме того, ответ на LPS был значительно выше, чем спонтанная секреция, что вместе взятые подтверждает способность клеток реагировать на стимулы.Использование криоконсервированных PBMC в этом исследовании было необходимо из-за дизайна исследования, поскольку было невозможно проверить клеточные иммунные ответы в свежевыделенных PBMC от тысяч невыбранных детей. Более ранние сообщения о влиянии криоконсервации на секрецию цитокинов с помощью ELISPOT показали общее снижение секреции IL-4 в криоконсервированных клетках по сравнению со свежими клетками как в спонтанной, так и в индуцированной аллергеном секреции, тогда как секреция IFN-γ была меньше затронута [30]. . Таким образом, в некоторой степени криоконсервация может объяснить низкие уровни секретирующих IL-4 клеток, обнаруженные в этом исследовании, по сравнению с более ранними исследованиями со свежеприготовленными PBMC от детей (1-17 лет) [18].Это

также важно отметить, что образцы крови у детей были взяты после инфицирования, а не во время фактического инфицирования, в соответствии с планом исследования.

Также следует учитывать юный возраст детей. Способность отвечать IFN-γ нарушается у новорожденных [31] и развивается в детстве [32, 33]. Все дети в нашем исследовании были 5-летнего возраста, поэтому можно было ожидать полной способности отвечать IFN-γ на стимулы [34, 35].Аналогичная способность была обнаружена при сравнении секреции IFN-γ, индуцированной PHA, в нашем настоящем исследовании с секрецией IFN-γ, индуцированной PHA, у взрослых [17].

Независимо от того, действительно ли дети с предыдущей клинической LB подвержены воздействию Borrelia, пациенты могут быть предметом обсуждения. Данные в нашем настоящем исследовании основаны на самооценке информации, которая может иметь недостатки. Тем не менее, большинство пациентов сообщали о предыдущей ЭМ, что является четким клиническим диагнозом, и, хотя они сами сообщили, диагноз

Было заявлено, что

был установлен врачом и лечился антибиотиками.Очень немногие из детей с предыдущей клинической LB были серопозитивными на Borrelia (n = 4, таблица 1), но это было ожидаемо, поскольку EM — клинический диагноз, установленный врачом, чувствительность теста EM низкая, а уровни антител могут быть низкими. снижается после лечения антибиотиками [36]. Предыдущее лечение антибиотиками в этой группе теоретически могло также повлиять на иммунный ответ. Более того, необходимо помнить, что в нашем исследовании в основном оцениваются дети с предыдущей ЭМ (только 5 детей с параличом лицевого нерва и 1 с менингитом), поэтому выводы об иммунных ответах на диссеминированные LB не могут быть сделаны на основе наших данных.

Кроме того, вопрос о том, являются ли дети, подвергшиеся воздействию Borrelia, бессимптомно, «действительно» заражены Borrelia или являются ложно серопозитивными, также может быть предметом обсуждения. Мы не проводили никаких подтверждающих тестов, поскольку специфичность теста высока [37], а в более ранних исследованиях у взрослых, подвергшихся бессимптомному воздействию Borrelia, был отмечен специфический для Borrelia T-клеточный ответ в PBMC, что свидетельствовало об истинном воздействии [38]. . Таким образом, мы считаем, что ложные серопозитивные образцы не должны быть проблемой для нашего материала.

Мы обнаружили тенденцию к более высокому уровню спонтанной секреции IL-6 (от Luminex) у детей с предыдущей клинической LB (рис. 4). IL-6 представляет собой плейотропный цитокин, который в основном опосредует провоспалительные эффекты, и он индуцирует секрецию IL-17 из наивных Т-клеток [39] и, следовательно, может вместе с IL-17 участвовать в патогенезе LB. Недавно было высказано предположение, что IL-17 может вносить вклад в патогенез Лайм-артрита и NB [40, 41]. Таким образом, можно предположить, что IL-6 вместе с IL-17 может участвовать в воспалительных механизмах, способствующих клиническим проявлениям LB.Однако в настоящем исследовании мы обнаружили только тенденцию к повышенной спонтанной секреции IL-6, но не обнаружили секреции IL-6 или IL-17, индуцированной Borrelia. Возможно, это можно объяснить тем фактом, что мы анализировали PBMC после воспаления, а не образцы из иммунных привилегированных участков во время активного воспаления. Таким образом, роль IL-6 вместе с IL-17, безусловно, интересна с точки зрения патогенеза LB, но требует дальнейшего изучения.

Наконец, почему у некоторых людей развивается клиническое заболевание при встрече с B.burgdorferi s.l. а некоторые не остаются неясными. Важны ли конкретные свойства иммунной системы хозяина, все еще не понятно, и, по общему признанию, могут быть другие важные аспекты. Например, генотипы Borrelia, инфицирующие человека, могут играть существенную роль в различных клинических исходах, наблюдаемых при LB. Хорошо известно, что разные геновиды B. burgdorferi s.l. могут вызывать разные клинические проявления, и также хорошо известно, что разные геновиды обладают разными способностями к выходу из системы комплемента, тем самым избегая элиминации [42].Эти аспекты, а также индивидуальная генетическая предрасположенность могут быть решающими факторами в понимании механизмов взаимодействия спирохет и хозяина, и необходимы будущие исследования в этих областях.

В заключение, наши результаты не показывают различий в адаптивном или врожденном иммунном ответе на B. burgdorferi s.l. при сравнении бессимптомных детей и детей, подвергшихся воздействию Borrelia, с предыдущими клиническими проявлениями LB. Таким образом, иммунологический

механизмов, важных для эффективного уничтожения спирохет без развития клинических проявлений LB, остаются неизвестными.

Список сокращений

ABIS: «Все дети в юго-восточной Швеции» B. burgdorferi s.l .: Borrelia burgdorferisensu lato

CEF: Пул пептидов, состоящий из 32 пептидов, полученных из цитомегаловируса человека, вируса Эпштейна-Барра и вируса гриппа

ЦСЖ: спинномозговая жидкость

DC: дендритная клетка

ELISA: иммуноферментный анализ

ELISPOT: иммуноферментный анализ

EM: Мигрирующая эритема

f: Женский

FCS: Фетальная сыворотка теленка

IFN-y: Интерферон гамма

Ig: иммуноглобулин

ИЛ: Интерлейкин

LB: боррелиоз Лайма

LPS: липополисахариды

м: Мужской

Примечание: Нейроборрелиоз

OF: Фракция, обогащенная белками внешней поверхности

OD: оптическая плотность

PAMP: молекулярные структуры, связанные с патогенами

PBMC: мононуклеарные клетки периферической крови

PHA: Фитогемагглютинин A

PRR: рецепторы распознавания образов

SPSS: статистические продукты и сервисные решения

TCM: Среда для культивирования тканей

Th2: Т-хелперные лимфоциты типа 1

Th3: Т-хелперные лимфоциты 2 типа

Th27: Т-хелперные лимфоциты типа 17

TLR: толл-подобный рецептор

TNF: фактор некроза опухоли

TT: Столбнячный анатоксин.

Конфликт интересов

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарность

Авторы выражают огромную благодарность всем участвующим детям / родителям. Они также хотят поблагодарить сотрудников Службы охраны здоровья детей в регионе, а также отличных медсестер-исследователей и техников, участвовавших в исследовании ABIS, в частности Ингелу Йоханссон и Гози Смолинску. Особая благодарность выражается также Мари-Анне Акесон и Петре Кассель за превосходные знания в области анализа ELISPOT и Luminex соответственно.Кроме того, они очень благодарны сотрудникам кафедры молекулярной биологии Университета Умео за поставку антигена Borrelia OF. Исследование было поддержано грантом Исследовательского совета Юго-Восточной Швеции

.

(FORSS), Совет графства в Остерготланде, Шведский

Фонд детского диабета, Исследование ювенильного диабета

Фонды

, Фонд Holmia и Центр

Клинические исследования в Даларне (CKF).

Список литературы

[1] G. Stanek и F. Strle, «Лайм-боррелиоз», Lancet, vol. 362, нет. 9396, стр. 1639-1647, 2003.

[2] А. С. Стир, «Лаймский боррелиоз в 2005 г., через 30 лет после первоначальных наблюдений в Лайме, Коннектикут», Wiener Klinische Wochenschrift, vol. 118, вып. 21-22, стр. 625-633, 2006.

[3] Х. Дж. Кристен, Ф. Ханефельд, Х. Эйфферт и Р. Томсен, «Эпидемиология и клинические проявления боррелиоза Лайма в детстве.Проспективное многоцентровое исследование с особым вниманием к нейроборрелиозу, Acta Paediatrica, Supplement, vol. 82, no. 386, pp. 1-75, 1993.

[4] J. Berglund, L. Stjernberg, K. Ornstein, K. Tykesson-Joelsson и H. Walter, «5-летнее наблюдение пациентов с нейроборрелиозом», Scandinavian Journal of Infectious Diseases, vol. 34, нет. 6. С. 421-425, 2002.

.

[5] М. Васкес, С. С. Спарроу и Э. Д. Шапиро, «Долгосрочные нейропсихологические последствия и последствия для здоровья детей с параличом лицевого нерва, вызванным болезнью Лайма», Педиатрия, том.112, нет. 2, стр. E93-e97, 2003.

[6] Б. Х. Скогман, С. Кронер, М. Нордвал, М. Экнефельт, Дж. Эрнеруд и П. Форсберг, «Лайм-нейроборрелиоз у детей: проспективное исследование клинических особенностей, прогноза и исходов», «Детское инфекционное заболевание». Журнал, т. 27, нет. 12. С. 1089-1094, 2008.

.

[7] Р. Меджитов и К. Джейнвей-младший, «Семейство рецепторов Toll и распознавание микробов», «Тенденции в микробиологии», вып. 8, вып. 10. С. 452-456, 2000.

[8] М. Хиршфельд, Г. Дж. Киршнинг, Р. Шванднер и др., «Передний край: воспалительная передача сигналов липопротеинами Borrelia burgdorferi опосредуется toll-подобным рецептором 2», Journal of Immunology, vol. 163, нет. 5. С. 2382-2386, 1999.

.

[9] Дж. Сухонен, Дж. Коми, Дж. Соукка, О. Лассила и М. К. Вилья-нен, «Взаимодействие между Borrelia burgdorferi и незрелыми дендритными клетками человека», Скандинавский журнал иммунологии, вып. 58, нет. 1. С. 67-75, 2003.

[10] В.А. Деннис, С. Диксит, С.М. О’Брайен, X. Альварес, Б. Пахар и М.Т. Филипп, «Живые спирохеты Borrelia burgdorferi вызывают воспалительные медиаторы из моноцитов человека через путь передачи сигнала толкового рецептора», Инфекция и иммунитет , т. 77, нет. 3. С. 1238-1245, 2009.

.

[11] А. С. Стир, Дж. Коберн и Л. Гликкштейн, «Возникновение болезни Лайма», Журнал клинических исследований, вып. 113, нет. 8. С. 1093-1101, 2004.

[12] М.Д. МакКисич и С. В. Бартольд, «Независимые от Т-клеток ответы на Borrelia burgdorferi имеют решающее значение для защитного иммунитета и разрешения болезни Лайма», Infection and Immunity, vol. 68, нет. 9. С. 5190-5197, 2000.

.

[13] Дж. Чжу и В. Э. Пол, «CD4 Т-клетки: судьбы, функции и недостатки», Blood, vol. 112, нет. 5. С. 1557-1569, 2008.

.

[14] Т. Р. Мосманн и С. Сад, «Расширяющаяся вселенная субпопуляций Т-клеток: Th2, Th3 и другие», Immunology Today, vol.17, нет. 3. С. 138-146, 1996.

.

[15] А. Пек и Е. Д. Меллинс, «Неустойчивый баланс: клетки Th27 в защите хозяина», Инфекция и иммунитет, т. 78, нет. 1. С. 3238, 2010.

.

[16] Дж. Окси, Дж. Саволайнен, Дж. Пене, Дж. Буске, П. Лайппала и М. К. Вильянен, «Снижение уровня интерлейкина-4 и повышение гаммы.

Продукция интерферона

мононуклеарными клетками периферической крови пациентов с Лайм-боррелиозом, «Инфекция и иммунитет», т.64, нет. 9. С. 3620-3623, 1996.

.

[17] К. Экерфельт, Дж. Эрнеруд, Дж. Буникис и др., «Компартментализация антиген-специфических цитокиновых ответов на центральную нервную систему при боррелиозе ЦНС: секреция IFN-γ преобладает над секрецией IL-4 в ответ. к белкам внешней поверхности болезни Лайма Borrelia spirochetes, «Journal of Neuroimmunology, vol. 79, нет. 2, pp. 155–162, 1997.

[18] M. Widhe, BH Skogman, S. Jarefors et al., «Повышение регуляции Borrelia-специфических IL-4- и IFN-y-секретирующих клеток в спинномозговой жидкости у детей с нейроборрелиозом Лайма», International Иммунология, т.17, нет. 10. С. 1283-1291, 2005.

.

[19] М. Видхе, С. Джарефорс, К. Экерфельт и др., «Боррелиоз-специфическая секреция интерферона-γ и интерлейкина-4 в спинномозговой жидкости и крови во время лимфоборрелиоза у людей: связь с клиническим исходом», Журнал Инфекционные болезни, т. 189, нет. 10. С. 1881–1891, 2004.

[20] К. Экерфельт, П. Форсберг, М. Свенвик, М. Роберг, С. Бергстром и Дж. Эрнеруд, «Бессимптомные серопозитивные к Borrelia индивиды демонстрируют такую ​​же заболеваемость Borrelia-специфическим гамма-интерфероном (IFN-γ). ) -секретирующие клетки в крови у пациентов с клинической инфекцией Borrelia, «Клиническая и экспериментальная иммунология», вып.115, нет. 3. С. 498-502, 1999.

.

[21] J. Sjowall, A. Carlsson, O. Vaarala et al., «Врожденные иммунные ответы при боррелиозе Лайма: усиление фактора некроза опухоли-а и интерлейкина-12 у бессимптомных лиц в ответ на живые спирохеты», Клинические и экспериментальные Иммунология, т. 141, нет. 1. С. 89-98, 2005.

[22] Б.Х. Скогман, К. Экерфельт, Дж. Людвигссон и П. Форсберг, «Распространенность серотипов антител IgG к боррелии среди маленьких шведских детей в связи с зарегистрированными укусами клещей, симптомами и предшествующим лечением боррелиоза Лайма: обследование населения , «Архив болезней детства», т.95, нет. 12. С. 1013-1016, 2010.

.

[23] П. Форсберг, Дж. Эрнеруд, К. Экерфельт, М. Роберг, М. Фретем и С. Бергстром, «Белки внешней поверхности спирохет Borrelia при болезни Лайма стимулируют Т-клетки к секреции интерферона-гамма (IFN- у): диагностические и патогенетические последствия, «Клиническая и экспериментальная иммунология», т. 101, нет. 3. С. 453-460, 1995.

.

[24] К. Хансен и Э. Асбринк, «Серодиагностика мигрирующей эритемы и хронического атрофического акродерматита с помощью иммуноферментного анализа Borrelia burgdorferi flagellum», Журнал клинической микробиологии, вып.27, нет. 3. С. 545551, 1989.

.

[25] S. Axelsson, M. Faresjo, M. Hedman, J. Ludvigsson и R. Casas, «Криоконсервированные мононуклеарные клетки периферической крови подходят для оценки иммунологических маркеров у детей с диабетом 1 типа», Cryobiology, vol. 57, нет. 3. С. 201-208, 2008.

.

[26] С. Бергстром, А. Шостедт, Л. Дотевалл и др., «Диагностика боррелиоза Лайма с помощью иммуноферментного анализа, выявляющего иммуноглобулин G, реактивный к очищенным компонентам клеток Borrelia burgdorferi», Европейский журнал клинической микробиологии и инфекционных заболеваний. , т.10, вып. 5, pp. 422-427, 1991.

[27] Л. А. Магнарелли, Дж. Ф. Андерсон и А. Г. Барбур, «Иммуноферментные анализы на болезнь Лайма: реактивность субъединиц Borrelia burgdorferi», Journal of Infectious Diseases, vol. 159, нет. 1. С. 43-49, 1989.

.

[28] К. Черкински, Г. Андерссон, Х. П. Экре, Л. А. Нильссон, Л. Клареског и О. Оуктерлони, «Обратный анализ ELISPOT для клонального анализа продукции цитокинов. I. Подсчет

клеток, секретирующих гамма-интерферон, «Журнал иммунологических паралогов поверхностного белка Е», Журнал иммунологии, вып.169,

Методы, т. 110, нет. 1, pp. 29-36, 1988. № 7. С. 3847-3853, 2002.

.

[29] S. Jarefors, CK Janefjord, P. Forsberg, MC Jenmalm и C. Ekerfelt, «Снижение регуляции интерлейкина-12Rj82-цепи и секреции интерферона-γ и увеличение количества клеток, экспрессирующих P3 бокса вилки». у пациентов с хроническим боррелиозом Лайма в анамнезе по сравнению с бессимптомными лицами, контактировавшими с боррелиями, «Клиническая и экспериментальная иммунология», т.147, нет. 1. С. 18-27, 2007.

[30] М. Кварнстром, М.С. Дженмальм и К. Экерфельт, «Влияние криоконсервации на экспрессию цитокинов Th2 и Th3 в мононуклеарных клетках крови пациентов с различными профилями цитокинов, проанализированных с помощью трех общих тестов: общее снижение интерлейкинов- 4, «Криобиология», т. 49, нет. 2. С. 157-168, 2004.

[31] Й. Дж. Брайсон, Х. С. Винтер и С. Е. Гард, «Дефицит выработки иммунного интерферона лейкоцитами здоровых новорожденных», Cellular Immunology, vol.55, нет. 1. С. 191-200, 1980.

.

[32] П. Г. Холт и К. А. Джонс, «Развитие иммунной системы во время беременности и в раннем периоде жизни», Аллергия, т. 55, нет. 8. С. 688-697, 2000.

.

[33] М. Ф. Ботчер, М. К. Дженмальм и Б. Бьоркстен, «Иммунные реакции на березу у маленьких детей в течение первых 7 лет их жизни», Клиническая и экспериментальная аллергия, т. 32, нет. 12. С. 1690-1698, 2002.

.

[34] Ф. Хоффманн, М. Х. Альберт, С.Arenz et al., «Уровни внутриклеточных Т-клеточных цитокинов у здоровых детей и взрослых зависят от возраста», European Cytokine Network, vol. 16, нет. 4. С. 283288, 2005.

.

[35] В. Вигеринг, М. Эйрих, К. Вундер, Х. Гюнтер, П. Г. Шлегель и Б. Винклер, «Возрастные изменения внутриклеточной экспрессии цитокинов у здоровых детей», European Cytokine Network, vol. 20, нет. 2. С. 75-80, 2009.

[36] С. Хаммерс-Берггрен, А. М. Лебек, М. Карлссон, Б.С. Нгссон, К. Хансен и Г. Штирнштедт, «Серологическое наблюдение после лечения пациентов с мигрирующей эритемой и нейроборрелиозом», Журнал клинической микробиологии, вып. 32, нет. 6. С. 1519-1525, 1994.

.

[37] А. Смисманс, В. Дж. Гуссенс, Э. Нуленс и К. А. Брюггеман, «Сравнение пяти различных иммуноанализов для обнаружения антител Igm и IgG к Borrelia burgdorferi», «Клиническая микробиология и инфекция, вып. 12, вып. 7. С. 648-655, 2006.

.

[38] С.Экерфельт, К. Масрелиес, М. Свенвик, Дж. Эрнеруд, М. Роберг и П. Форсберг, «Антитела и Т-клеточная реактивность к Borrelia burgdorferi в бессимптомной популяции: исследование здоровых доноров крови в районе внутреннего города в Юго-Восток Швеции, Scandinavian Journal of Infectious Diseases, vol. 33, нет. 11. С. 806-808, 2001.

.

[39] Ф. Саллусто и А. Ланзавеккья, «Клетки Th27 человека при инфекции и аутоиммунитет», «Микробы и инфекции», том. 11, вып. 5. С. 620-624, 2009.

[40] AJ Henningsson, I. Tjernberg, BE Malmvall, P. Forsberg и J. Ernerudh, «Показания Th2 и Th27 ответов в спинномозговой жидкости у пациентов с нейроборрелиозом Лайма: большое ретроспективное исследование», Journal of Neuroinflampting, vol. . 8, 2011.

[41] М. Нордберг, П. Форсберг, А. Йоханссон и др. «Цитотоксические механизмы могут играть роль в локальном иммунном ответе центральной нервной системы при нейроборрелиозе», Journal of Neuroimmunology, vol.232, нет. 1, стр. 186-193,2011.

[42] A. Alitalo, T. Meri, H. Lankinen et al., «Связывание фактора H-ингибитора комплемента со спирохетами болезни Лайма опосредуется индуцибельной экспрессией нескольких кодируемых плазмидами внешних

Авторские права на клиническую иммунологию и иммунологию развития являются собственностью Hindawi Publishing Corporation, и ее содержимое не может быть скопировано или отправлено по электронной почте на несколько сайтов или размещено в рассылке без письменного разрешения правообладателя.Однако пользователи могут распечатывать, загружать или отправлять по электронной почте статьи для индивидуального использования.

Guess Jeans — Ким Набозный

  • Реклама
  • Редакционная
  • Модные влиятельные лица
  • Кастинг
  • Филиалы
  • Катушка
  • Около
  • Реклама
  • Редакционная
  • Модные влиятельные лица
  • Кастинг
  • Локации
  • Катушка
  • О

61 горячие фотографии Сандры Хеллберг, которые невероятно завораживают

Она — одна из самых известных шведских моделей, за свою карьеру успела поработать в нескольких мастерских проектах.Речь идет о талантливой Сандре Хеллберг и ее прекрасной работе в качестве модели, которая на протяжении многих лет создавала для нее стабильную репутацию. Она также пользуется значительной благодарностью поклонников за ее работу на протяжении многих лет. Сандра Хеллберг также известна своей жизнью в социальных сетях, где у нее есть несколько подписчиков, и она держит их в курсе своей жизни.

Эта красивая модель родилась 19 марта 1989 года. Это означает, что на данный момент ей 31 год. Сандра Халльберг родилась в Швеции в красивом городе Стокгольм.У нее есть потрясающие черты для топ-модели. У нее пять футов восемь дюймов. У нее красивые голубые глаза, и она работала в нескольких эстетических съемках, на которых она снималась из-за своей красивой внешности. Она была связана с несколькими модельными агентствами по менеджменту, но ее самое долгое и наиболее заметное сотрудничество было с MIKAs Stockholm.

Она наиболее известна своей работой со знаменитым брендом Guess. Она была частью их серии «Аксессуары осень 2013», где она шла по пандусу и позировала для нескольких снимков.Она также была связана с другими их работами на протяжении многих лет. Среди известных фотографов, с которыми она работала, — Хантер и Гатти, Пульманнс и многие другие.

В 2012 году она также снималась для сериала «Марчиано Холидей», который снова работал на Guess. Она также появлялась на обложках нескольких известных модных журналов по всему миру. Хотя эта красивая модель держит свою личную жизнь в секрете, считается, что на данный момент она не состоит ни в каких отношениях и не замужем.

Теперь, когда мы предоставили достаточно информации о Сандре Хеллберг, пора перейти к следующему сегменту, которого вы все так долго ждали! Да! Пришло время погрузиться в себя и стать свидетелем красоты и стиля этой модно гламурной малышки в ее многочисленных позах и позах в этой тщательно подобранной изобилии горячих картинок Сандры Хеллберг, предназначенных исключительно для наших посетителей и зрителей. Мы уверены, что фанаты будут более чем в восторге, увидев эти сексуальные фотографии Сандры Хеллберг и полюбоваться ими, которые, несомненно, придутся им по душе и понравятся! Каждый ее снимок — это посвящение ее бесспорно непревзойденной красоте, и то же самое можно увидеть в этой бесценной коллекции изображений сисек Сандры Хеллберг.Полюбуйтесь видом этой дивы, любуясь ее восхитительно гладкими и восхитительными фотографиями задниц Сандры Хеллберг и изображениями задниц Сандры Хеллберг. Большинство этих фотографий включают изображения бикини Сандры Хеллберг из самых сексуальных фото Сандры Хеллберг в Instagram, которые демонстрируют ее дикая сторона и великолепные формы! Без лишних слов, давайте сразу же!

1. Сексуальные фотографии Sandrah Hellberg

61 горячая фотография Кристал Бойд, которая сделает вас ее самым большим поклонником

2. Горячие картинки Sandrah Hellberg

3.

4.

5.

6.

61 горячая фотография Джессики Ван Дер Стин, которая заставит вас задыхаться над

7.

8.

9.

10.

11.

61 горячие фотографии Кейтлин, которые в основном безупречны

12.

13.

14.

15.

16.

61 горячая фотография Бульмы вызовет у нее страстные чувства

17.

18.

19.

20.

21.

54 горячих фотографии Джоджо демонстрируют, что она такая горячая, как любой может представить

22.

23.

24.

25.

26.

61 горячая фотография Суэлин Медейрос — обращение для ее поклонников

27.

28.

29.

30.

31.

61 горячая фотография Лауры Марано, которая наверняка покорит ваше сердце

32.

33.

34.

35.

36.

61 горячие фотографии Неллиэль Ту Одельшванк обязательно оставят вас в недоумении

37.

38.

39.

40.

41.

61 горячая фотография Элисон Стоунер — очарование для ее поклонников

42.

43.

44.

45.

46.

61 горячая фотография Ryofu Housen просто чрезмерно загадочна

47.

48.

49.

50.

51.

65 сексуальных фотографий Кендалл Дженнер, которые демонстрируют, что она самая горячая леди на Земле

52.

53.

LEAVE A RESPONSE

Ваш адрес email не будет опубликован.