Трикотажная одежда для дома и отдыха для мужчин и женщин, в интернет магазине Ирис — домашний трикотаж!

Домашний трикотаж от производителя в Иваново, в интернет-магазине «Ирис — домашний трикотаж» Трикотаж дешево, купить ночные сорочки, купить туники, купить трикотаж

Разное

Цвет пальто: Непромокаемое ветрозащитное пальто цвет слоновой кости цвет

Содержание

Цвет и фактура ткани пальто

Колористическому оформлению предметов гардероба придается сегодня большое значение. Этому в большой степени поспособствовали ученые-психологи, объясняющие влияние того или иного оттенка на восприятие предмета человеком, эмоциональное состояние и даже на здоровье. Свои коррективы вносит Ее Величество Мода благодаря ежесезонной публикации таблиц ведущих цветов. Но есть еще личные предпочтения и вкусы, касающиеся не только расцветок и тонов, но и фактур материалов, которые также влияют на наши взгляды и отношения к изделиям швейной промышленности. Что это означает применительно к пальто, рассмотрим подробнее.

Гладкость или лохматость?

Разнообразие пальтовых тканей по виду лицевой поверхности очень велико, и каждый год производятся новые их виды. Популярность ворсованных полотен, таких как кашемир, пальтовый бархат, драп с начесом объясняется хорошими теплозащитными свойствами, ведь подсознательно мы понимаем, что воздух в порах и между ворсинок является барьером для холода.

Благодаря такому спросу основой ассортимента в магазинах пальто становятся изделия из этих материалов.

Но, в последнее время, набрала вес тенденция использования для зимней и осенней одежды тканей с гладким, скользким и блестящим видом, как правило, тонких. Для выполнения основной функции в пальто из них используется утепляющая прокладка, состоящая из пухового пакета или синтепона. Сам основной материал только внешне имеет сходство с болоньей. Качество новинок выше, надежность в носке больше. Особенно радует скатывание капелек влаги, из-за чего изделие становится неуязвимым для дождя и мокрого снега.

Эти два пограничных вида поверхности – ворсованный и гладкий – имеют свои достоинства и недостатки. Так «пушистые» пальто выглядят уютнее, но менее практичны в носке и немного полнят.  Плащевка и болонья хорошо сохраняют цвет и очень современны, спортивны и энергичны. Но они не гарантируют изделию интеллигентного и дорогого налета, свойственного кашемировым тканям, а блеск, опять же, создает ощущение избыточного объема.

Осторожно с цветом

Каталоги пальто все чаще начинают пестреть яркими оттенками и радужными переливами. Так мода реагирует на унылость осенних и зимних дней. Но любителям выделиться нужно помнить о простейших правилах, накладываемых цветом на любые изделия, в том числе, зимнюю и осеннюю одежду. Они всем известны, но все же: темные цвета стройнят, светлые – визуально расширяют силуэты; притененные оттенки более элегантны при общих условиях, нежели чистые и насыщенные; теплые тона добавляют несколько сантиметров к обхватам по сравнению с холодными.

В общей композиции пальто-шарф-шапка-сапоги-сумочка не желательно использовать более чем 3-4 цвета, даже при условии их хорошей сочетаемости. Идеально, если в костюме только одно яркое притягательное для глаз пятно, и оно не отвлекает от лица «модели».

Крупный рисунок, например, клетка или горох на пальто, может оказать плохую услугу как излишне полным, так и миниатюрным дамам. Вертикальные полосы стройнят, горизонтальные — полнят, комбинации из наклонных скрывают истинные пропорции.

Манипулирование цветом пальто интересно тем, что в зависимости от оттенка крупного шарфа или высокой обуви могут создаваться различные эффекты контрастов: насыщенности, размеров, холодного и теплого, светлого и темного. Примеряя получаемые варианты на себя, необходимо найти свое сочетание – то, при котором лицо будет смотреться наиболее выигрышно.

Золотая середина

Профессионалы, работающие в домах моды и на фабриках пальто, научились использовать слабые и сильные стороны цветов и фактур в одном изделии. Во-первых, разные материалы или их тона используются для основных деталей и для несущих отделочно-декоративную функцию: воротников, манжет, пелерин, клапанов. Это позволяет в некоторой степени удешевить изделие, ведь более шикарной ткани нужно меньше, а ее красота используется на полную.

Другой вариант состоит в комбинировании разных тканей на основных деталях. Например, коротковорсовый искусственный мех может ставиться на верхнюю часть рукава, а нижняя выполняется из простого драпа. Тем самым уменьшают свойлачиваемость ворса в зонах возникновения трения при носке. Изящество фигуры повышают, выполняя центральные части переда и спинки из боле светлых или ярких тканей, а боковые из темных или тусклых.

Таких приемов, находящихся в арсенале модельеров, достаточно много. Чтобы их заметить, нужно лишь немного внимания.

Цвет и фактура материала являются такими же неотъемлемыми атрибутами модели, как крой, длина, качество посадки на фигуре.  Неудачный их выбор может свести на нет старания целой группы специалистов, а успешное решение — сделать самую простую модель элегантной и броской. Задача же потребителя продукции состоит в том, чтобы найти для себя оптимальное сочетания всех факторов и характеристик в одном изделии. Пусть нам в этом повезет!

С чем носить пудровое пальто: 5 идеальных комбинаций

В этом сезоне многие девушки задаются вопросом: с чем носить пудровое пальто? Ведь уже несколько последних лет из моды не выходит одежда пастельных тонов. Этот сезон не стал исключением. И в качестве верхней одежды модницы предпочитают выбирать пальто пудрового оттенка. Этот цвет представляет нечто среднее между бежевым и бледно-розовым, в общем представляет собой оттенок пудры для лица. Выбрать для себя наиболее удачные сочетания и разобраться с чем носить пальто цвета пудры помогут фото и данная статья.

 

Содержание статьи

Актуальные модели пальто

В первую очередь при выборе модели пальто нужно учитывать для какого сезона будет использоваться данная вещь. Для зимы стоит брать варианты с утеплителем, а также с меховым воротником. Мех не только согреет в мороз, он также является модной декоративной деталью. В том случае, если на модели ворот из меха отсутствует, то его можно просто заменить меховым шарфом. Также возможны варианты с меховой отделкой или меховыми карманами. Пальто с мехом сейчас очень популярны.

К пудровому цвету пальто подойдёт мех следующих оттенков:

Наиболее модной моделью пальто в данный момент является вариант на поясе, без пуговиц и молний. Такое пальто с запахом немного напоминает халат, но при этом находится на пике популярности. Также актуальны модели oversize которые делают образ немного небрежным, но при этом очень стильным.

 

С чем носить пальто пудрового цвета: 5 интересных комбинаций

С чем носить пальто цвета пудры? Этот вариант верхней одежды отлично смотрится не только с романтическими платьями и каблуками, но и с более повседневным стилем: с джинсами, грубыми сапогами или ботинками и даже с кроссовками. Причём последнее сочетание сейчас в тренде. Рассмотрим комбинации подробней.

  • Повседневный вариант. Универсальность пудрового пальто в том, что оно прекрасно смотрится с большинством вещей из гардероба любой девушки. Поэтому его можно сочетать с любой самой невзрачной одеждой. В этом случае пальто само по себе станет ярким акцентом образа. Особенно эффектно выглядит сочетание с кожаной юбкой-карандаш.  Не менее стильным получится лук в комбинации с юбкой плиссе.
  • Вариант деним: сочетание пальто с черными джинсами. Это как раз оптимальный вариант для кроссовок. Так как джинсы — тоже универсальный предмет одежды, комбинировать такой образ можно с чем угодно. В качестве верха, кроме свитеров и кардиганов, отлично смотрятся рубашки.
  • Сочетание с платьем. Это могут быть самые разнообразные платья: различных фасонов и цветов. Такая комбинация смотрится очень гармонично.
  • Резиновые сапоги. Этот предмет гардероба не только весьма практичный, но и очень модный. Сейчас модели резиновой обуви делают стильными и почти не отличимыми от обычных сапог. Для сочетания с пальто пудрового оттенка подойдут сапоги, как нейтральных оттенков, так и ярких (например — фуксия).
  • Голубые аксессуары. Нежно-розовый оттенок прекрасно сочетается с пастельно-голубым. Поэтому удачным выбором для модниц будет выбор сумки или шарфа и шапки голубого цвета.
    Пальто цвета пудры представляет собой универсальный предмет одежды, комбинаций и сочетаний с которым можно составить массу.

Пальто пудрового цвета — с чем сочетается, наиболее удачные варианты

Теперь перейдём к вопросу: с чем сочетать пальто пудрового цвета. В зависимости от выбора остальной одежды к пальто пудрового оттенка, можно сделать свой образ динамичным и ярким, или же нежным и девичьим. Вот шесть наиболее удачных вариантов для сочетания:

  1. Синий цвет. К образу подойдут джинсы любого оттенка.
    Пастельные тона. Кроме голубого цвета, нежно-розовый оттенок пальто будет хорошо смотреться с другими нюдовыми оттенками.
  2. Белый цвет. Крайне непрактичный вариант для одежды в межсезонье, но в качестве цвета аксессуаров смотрится великолепно.
    Красный или оранжевый. Такое сочетание смотрится очень динамично и интересно. Для этого стоит подобрать юбку или брюки насыщенного оттенка.
  3. Серый цвет. Такое сочетание стоит выбирать для повседневного и делового стиля. Благодаря пудровому оттенку такое сочетание не будет смотреться скучно.
  4. Чёрный цвет. Этот цвет способен добавить образу строгости.

Какого цвета шарф подойдёт к пудровому пальто

Шарф — наиболее популярный согревающий аксессуар, который необходимо правильно подобрать к верхней одежде. Какой же шарф подойдёт к пудровому пальто?

В зависимости от сезона и погоды можно использовать шарфы из разных материалов: это могут быть модели из шёлка, вискозы, хлопка или вязанные шарфы. К пальто цвета пудры подойдёт любой из этих вариантов. Цвет и оттенок данного аксессуара стоит выбирать, используя советы из предыдущего раздела. Чтобы посмотреть со стороны, как смотрится женское пальто пудрового цвета с различными вариантами шарфов, стоит посмотреть фото-примеры с чем его носить.
Также не стоит забывать, что при выборе шарфа стоит ориентироваться на своё лицо. Поэтому перед покупкой стоит обернуть шарф вокруг лица и оценить как оно смотрится.

Пальто в пудровом оттенке выглядит элегантно и стильно, а главное его преимущество в том, что оно сочетается практически со всеми цветами. Трудности, что подобрать к данному оттенку, возникнуть не должно. Если после прочтения данной статьи всё ещё возникают вопросы с чем носить пальто пудрового цвета, то фото из модных журналов или интернета помогут сложить в голове желанный образ.

Какие цвета галстуков подходят к цветам рубашек: 12 рекомендаций

10 правил хорошего тона: как одеваться женщине в 55 лет стильно

C чем одеть юбку карандаш: 5 модных советов

Как одеваются француженки в повседневной жизни: 6 беспроигрышных вариантов

Итальянские бренды одежды для женщин — от массовых до лакшери

 

Укажите свой e-mail и получайте новые статьи на почтовый ящик

Коричневое пальто — лучший выбор для повседневного образа

Уже давно доказано влияние цвета на психологическое состояние человека. Поэтому одежда, которую мы носим, вызывает у окружающих различные ощущения и, порой, двоякие чувства. Коричневое пальто для многих женщин стало настоящим объектом поклонения, но некоторые считают его слишком скучным. Однако, несмотря на такое спорное отношение к коричневому, большинство людей предпочитают формировать базовый гардероб на основе этого природного цвета. Его легко комбинировать с другими и создавать с помощью полученных гармоничных сочетаний подходящий образ.

Особенности коричневого цвета

Теплота и мягкость коричневого цвета в одежде способствует дружескому общению, откровенным разговорам. Разнообразие коричневых оттенков позволяет выбрать именно тот, который подойдет к любой ситуации. В нем можно смело отправляться на важное собеседование или встречу. Ведь человек в коричневом костюме или пальто всегда выглядит солидным и надежным, готовым к длительным деловым отношениям.

Для яркой брюнетки со смуглой загорелой кожей и белокурой блондинки с голубыми глазами коричневый также может стать любимым. Тем более, что его магические свойства неразрывно связаны с землей. Именно с его помощью можно подчеркнуть незыблемость своих убеждений и уверенность в завтрашнем дне.

Модели

Дизайнеры одежды разрабатывают современные модели мужских и женских коричневых пальто, подбирают для них ткани. Самыми подходящими для верхней одежды считаются — шерсть, драп, кашемир, кожа, букле, твид. У каждого материала свои свойства, которые соответствуют разным погодным условиям и сезонам. К популярным в настоящее время относятся такие модели пальто:

  • классические, которые можно отнести к стандартному виду, и усовершенствованные;
  • с застежкой-молнией и особенно с запахом;
  • свободного фасона;
  • прямого кроя;
  • различные виды пончо;
  • зимние и демисезонные модели;
  • оверсайз, летучая мышь.

Длину пальто женщины выбирают самостоятельно. Поскольку нет определенных требований и своеобразных догм, утверждающих, какая именно длина верхней одежды востребована.

Оттенки

В коричневой гамме очень много различных оттенков. Самые светлые из них близки к бежевому, а вот крем-брюле уже можно считать полноценным коричневым, только довольно мягким и теплым. В одну группу с ним можно объединить песочный, известный всем по очень модным пальто camel, золотистый мокко, ореховый, каштановый. А вот землистый оттенок или жженая умбра подойдут для тех пальто, которым необходимы более темные ткани.

Женское коричневое пальто

Выбор верхней одежды зависит от цветотипа человека, который и определяет, теплым или холодным оттенкам отдать предпочтение. Возрастных ограничений никаких нет, коричневые пальто с радостью наденут пятилетние дети, молодые девушки и пожилые люди. Все дело в том, что даже в классических моделях нет такой категоричной, безапелляционной строгости. Большинство моделей ярких трехцветных пальто с преобладанием коричневого также подходят всем. Теплые оттенки медно-коричневого, ванильного или терракотового согреют ранним весенним утром и хмурым осенним днем.

Стиль

Популярность коричневых пальто связана с возможностью широкого выбора модных направлений. Верхняя одежда в такой гамме может быть следующих стилей:

  • классического — с его элегантностью, качеством и умеренностью;
  • романтического — мягко подчеркивающего достоинства фигуры, сочетающего различные объемы и отделку в виде рюшей, воланов или вышивки;
  • спортивного — со свободным кроем и укороченной длиной;
  • casual — повседневный тип верхней одежды, с четкими и лаконичными линиями кроя;
  • милитари — с прямыми или трапециевидными силуэтами, воротниками-стойками, накладными карманами, металлическими пуговицами и подчеркнутой линией плеч.

Модный образ нужно создавать с учетом особенностей фигуры, иначе пальто с неподходящим силуэтом может лишь усугубить ее недостатки.

Фасон

Лидирующие позиции в модных показах всегда занимают пальто с эффектными и оригинальными видами кроя. Прямые или в виде трапеции подходят людям с самыми разными фигурами, полным и худым. Дизайнеры разрабатывают все новые линии силуэта и вырезы горловины, экспериментируют с расположением и формой карманов. Объемные трехцветные полупальто, слегка мешковатые, но очень оригинальные, смотрятся довольно интересно.

Странные, на первый взгляд, модели с рукавами в три четверти не мешают движениям, нужно лишь подобрать более длинные перчатки или надеть свитер толстой вязки.

Коричневые пальто с капюшонами покоряют людей всего мира своей практичностью и универсальностью. В них не страшен пронизывающий ветер или внезапный снегопад, даже от моросящего дождика можно спрятаться на какое-то время.

Обувь

Цвет обуви, которую предполагают надеть под коричневое пальто, обычно имеет другие оттенки. Под классические модели подойдут черные сапоги и элегантные туфли. А вот пончо или модные классические кейпы-пальто дополнят ботильоны, ботфорты, лодочки на шпильках.

Аксессуары

Современные дизайнеры уже не настаивают на том, что цвета аксессуаров и обуви должны совпадать. Они советуют обратить внимание на красные оттенки при выборе сумок, так как их сочетание с коричневым смотрится очень гармонично. Дорогие кожаные перчатки составят целостный ансамбль с самыми дорогими моделями пальто. От них не стоит отказываться, если только не создается какой-либо эпатажный лук или спортивный. Цвет шапки может быть черным или поддерживающим цвет одного из предметов одежды. Также подойдут белые, красные шляпки, береты, вязаные модели.

С чем носить и какой лук создавать

Если под коричневым пальто просматривается одежда другого цвета, но такая же однотонная, то такой аутфит можно разбавить более ярким клетчатым шарфом. Светлый объемный шарф дополнит пальто оверсайз, а мягкая вязаная шапка гармонично вольется в любой, даже классический лук.

В молодежной моде свои приоритеты. Поэтому в мегаполисах и больших городах можно довольно часто встретить девушек в модных пальто с кроссовками или даже кедами. Фасоны пальто в этом случае обычно прямые, удлиненные или короткие, с небольшими воротниками, капюшонами.

Светло-коричневое

Очень модное пальто цвета какао, имеющее нежный розовый оттенок, носят с белым или розовым палантином или шапочкой, а вот аксессуары в этом случае лучше подбирать красного цвета.

Под светлое бежевое пальто подойдет черное или серое платье с большим вырезом и аксессуары, а в качестве освежающего элемента можно надеть белую блузку с отложным воротником. Светло-коричневое пальто песочного оттенка и леопардовый принт на платье великолепно дополняют друг друга. К такому комплекту подойду черные туфли, ботильоны или ботинки.

Темно-коричневое

Такое пальто будет выигрышно смотреться вместе с синими или темно-красными элементами одежды. Темно-коричневый — популярный оттенок, с ним легко создавать контрастные или спокойные сочетания. Его комбинация со светло-коралловой блузкой или платьем подчеркивает насыщенность и контрастность. А вместе с оранжевым или облепиховым цветом получится гармоничное сочетание, вызывающее воспоминания о теплой осени.

Темно-коричневый и холодный зеленый, например, полынь или малахитовый, создают интересную пару. Одежда из таких элементов подойдет светловолосым женщинам.

Замшевое

Оригинальное замшевое пальто больше всего подходит для начала осени, солнечных и сухих дней. Требующую специального ухода замшу не стоит носить в дождливые дни, так как грязь, попавшую на нее, будет довольно сложно очистить. Из-за особенностей материала фасоны замшевых пальто довольно простые и приближены к классическим. С ними хорошо смотрятся закрытые темно-коричневые туфли на невысоком каблуке и бежевые сумки.

С меховой отделкой

Зимнее коричневое пальто с мехом весьма популярно в холодный период. Эта отделка улучшает внешний вид этих модных изделий, делает их более элегантными. С ними непременно нужно носить стильную обувь и дорогие аксессуары.

Короткое

Коричневые укороченные пальто, больше похожие на куртки, уже несколько сезонов не теряют свое популярности. Универсальность изделий позволяет носить их с брюками, узкими юбками и джинсами.

Без воротника

Такое пальто дает возможность выбора самых разных шарфов в холодную погоду, а в теплую допускает его использование без дополнительных элементов. Это позволяет создавать самые разные образы и подбирать стильную одежду. Иногда эту модель носят с теплым вязаным свитером с высоким воротом.

С чем носить мужское коричневое пальто

В настоящее время никто не полагает, что мужское пальто коричневого цвета, как на фото, следует носить с деловыми костюмами или другой одеждой в классическом стиле. Новые направления в моде, более демократичные и допускающие смешение стилей, не ограничивают фантазию и возможность комбинирования различных элементов одежды. Поэтому так популярны пальто в стиле милитари, спортивном или casual.

Как построить образ в зависимости от модели пальто

Фасонов и моделей мужских пальто много. Они могут быть прямыми и приталенными, короткими или более длинными, с различными воротниками и карманами или вообще похожими на военный бушлат. К темно-коричневому пальто идеально подходит коричневый жилет и такого же цвета оксфорды из замши.

Еще одним видом консервативного лука можно назвать комплект коричневого пальто, серого костюма с бежевой водолазкой и желтоватых кед. Для рабочих будней пригодится сдержанный лук из темно-коричневого укороченного пальто и синих зауженных джинсов.

С какой одеждой по цвету сочетать

Независимо от оттенка коричневого, одежда черного цвета, надетая под пальто, создаст довольно интересное, контрастное сочетание. Особенно выразительно в этом случае станут смотреться бежевые, горчичные, кирпичные или шоколадные оттенки.

Прекрасный комплект одежды, подходящий для самых разных случаев, — коричневое пальто, брюки другого оттенка или черные и, конечно же, белые рубашки и свитера. Для создания делового образа и фешенебельного внешнего вида мужчины дополняют коричневое пальто одеждой белого и черного, серого цветов и другими пастельными оттенками.

Обувь и аксессуары

Формирование мужского лука на базе коричневого позволяет полностью ориентироваться на индивидуальные предпочтения. Аксессуары легко выбрать из самых популярных на данный момент шляп, зонтов, кожаных перчаток, стильных солнцезащитных очков, шарфов. Их можно брать в любой «комплектации», а вот цвета подбирать нужно очень тщательно. Для мужского образа важна сдержанность, поэтому количество задействованных оттенков следует ограничить. Обувь должна соответствовать общему стилю. Если это классика, то черные туфли и ботинки значительно усилят общее впечатление.

Полезные советы

Большинство моделей коричневых пальто смотрятся очень фешенебельно, поэтому их принято совмещать с оттенками синего, зеленого и красного цвета. Но и лук, созданный на тональной растяжке сочетаний коричневых оттенков, может быть довольно интересным как для мужчин, так и для женщин.

Длинное пальто коричневого цвета подходит только для мужчин высокого роста, а вот женщины могут дополнить образ обувью на высоком каблуке и этим устранить возможную проблему. Тем, кто часто ездит за рулем, лучше выбирать короткое коричневое пальто.

Шерстяные пальто, в отличие от синтетических, при надлежащем уходе долго служат и сохраняют первоначальный вид. Такие модели мужских пальто как честерфилд, несмотря на всю роскошь и качество материала, органично вписываются в деловой стиль.

Коричневое пальто – универсальный элемент и мужского, и женского гардероба. Эту базовую вещь можно сочетать с джинсами и классическими брюками, кедами и элегантными туфлями. Благодаря особенности цвета пальто получится удачно вписать как в деловой дресс-код, так и в повседневный городской лук.

границ | Новый бледно-желтый окрас шерсти кроликов, полученный посредством мутации MC1R с помощью системы CRISPR / Cas9

Введение

Цвет шерсти животного — одна из наиболее важных характеристик породы, которая является не только важным продуктивным признаком, но и незаменимым экономическим признаком. В качестве важного генетического маркера для молекулярной селекции долгое время большое внимание уделялось наследованию цвета шерсти кроликов. У млекопитающих локус Extension кодирует рецептор меланокортина 1 (MC1R), который в основном экспрессируется в волосяном фолликуле и меланоците кожи, тесно связанных с пигментацией кожи.Активация альфа-меланоцит-стимулирующего гормона (MSH) инициируется комплексной передачей сигналов MC1R, что приводит к производству черного и темно-коричневого пигментов эумеланина. Сигнальный белок агути (ASIP) противодействовал рецепторам разными путями, вызывая переключение с пигмента эумеланинового типа на феомеланин (Lu et al., 1994; Ollmann et al., 1998) и продуцируя желтые или красные пигменты. MC1R — высокополиморфный ген. Мутации в некоторых локусах однонуклеотидного полиморфизма (SNP) были показаны в изменении цвета шерсти млекопитающих, таких как красная морская свинка (Cone et al., 1996), каштановая лошадь (Marklund et al., 1996) и корова голштинской породы с красной кожей (Joerg et al., 1996). Кроме того, мутаций гена MC1R , связанных с разными цветами шерсти, были описаны у людей (Valverde et al., 1995), мышей (Robbins et al., 1993), свиней (Kijas et al., 1998; Kijas et al., 2001), крупный рогатый скот (Klungland et al., 1995; Rouzaud et al., 2000), овцы (Vage et al., 1999), козы (Fontanesi et al., 2009), собаки (Everts et al., 2000; Newton et al., 2000), куры (Kerje et al., 2003) и лисы (Vage et al., 1997; Vage et al., 2005), при котором количество функциональных мутаций увеличивалось, приводя к черному / темному окрасу шерсти, а отсутствие функций обычно приводило к первоначальному / желтому окрасу шерсти.

На домашних кроликах ( Oryctolagus cuniculus ) традиционные генетические исследования проводились в экспериментах по скрещиванию пород с разным окрасом шерсти, в которых в локусе Extension были распознаны пять аллелей, представляющих следующее: E D показывает черный доминант ; E S представляет собой сталь, являющуюся более слабой версией E D ; E дикого типа (WT) выражает нормальный серый цвет или расширение черного цвета; e J существует в японском цвете тигрового окраса с мозаичным распределением желтого и черного цветов; и е выражает красно-желтый вид с белым животом.Порядок E D > E S > E> e J > e показал доминирование (Robinson, 1958; Fox, 1994). Fontanesi et al. (2006) идентифицировали делецию в рамке считывания, связанную с двумя возможными вариантами: рецессивный красный (c.304_333del30; аллель e) и черный доминантный (c.280_285del6; аллели E D и / или E S ) окраса шерсти посредством секвенирования почти полной кодирующей последовательности (CDS) кроличьего гена MC1R . Осведомленность о роли и механизме гена MC1R в определении окраски шерсти в основном зависела от анализа спонтанных мутаций у сельскохозяйственных животных.Специфичные для генома манипуляции важны для дальнейшего изучения функции гена MC1R и обеспечения понимания механизма окраски шерсти с изменением и формированием путем точной модификации в гене MC1R .

Хотя широко известно, что полиморфизм гена MC1R связан с окрасом шерсти животных, большинство исследований сосредоточено только на корреляции между спонтанными мутациями и фенотипом у различных видов животных. По-прежнему отсутствуют эффективные модели животных MC1R -нокаут (KO) для дальнейшего изучения функции MC1R .Здесь, используя систему редактирования генома CRISPR / Cas9, мы можем частично или полностью разрушить структуру белка MC1R , что может помочь нам лучше понять механизм этого гена. Более того, это первое исследование с использованием этой системы для создания модели млекопитающего и изучения функции MC1R, а использование системы CRISPR / Cas9 позволяет искусственно получать животных с популярными или новыми цветами шерсти.

В попытке выяснить, соответствует ли фенотип, продуцируемый искусственно модифицированным геном MC1R , фенотипу спонтанной мутации с потерей функции, мы нокаутировали ген MC1R черного кролика Ляньшань (BR). с помощью двойной sgRNA-управляемой системы CRISPR / Cas9 и получили двух мутировавших кроликов MC1R с бледно-желтой шерстью, которые заметно отличались от диких желтых кроликов.В нашей настоящей работе мы впервые обнаружили новый цвет шерсти у кроликов путем прерывания гена MC1R через CRISPR / Cas9. Кролик MC1R -KO может быть использован в качестве модели для дальнейшего изучения информации гена MC1R о различных цветах шерсти.

Материалы и методы

Отбор проб кроликов

Зажимы для ушей пяти отдельных кроликов [один BR, один YR, один новозеландский белый кролик (WR), один серый гигантский кролик (GR) и один клетчатый гигантский кролик (CR)] были взяты образцы, и геномная ДНК была извлечена из тканевого лизата с использованием фенол-хлороформа и выделена осаждением спиртом.

Клонирование и анализ кролика

MC1R

Для клонирования и анализа гена кролика MC1R в качестве матрицы для ПЦР-амплификации использовали геномную ДНК из BR, YR, WR, GR и CR в равных количествах (100 нг). парой специфических праймеров ( MC1R -F: 5′-GGTGGCTGGTGTGGAAATGT-3 ‘и MC1R -R: 5′-GCTGGCAAAGGGGCACTA-3′), которые были сконструированы на основе последовательности кролика MC1R : FN658676.1). Набор для экстракции геля (Omega Bio-Tec, США) использовали для очистки продукта ПЦР и для клонирования в вектор pMD18-T (Takara, Япония).Десять положительных клонов каждого кролика (всего 50 клонов) были секвенированы и затем проанализированы с использованием BioEdit и MEGA7. Кроме того, CDS гена MC1R двух других пород, кролика трианта (GenBank: FN658678.1) и японского тигрового окраса (GenBank: FN658679.1), были добавлены при множественном выравнивании последовательностей.

Дизайн sgRNA и конструирование плазмиды

В наших предыдущих опубликованных данных протоколы конструирования sgRNA и конструирования векторов были подробно обсуждены (Su et al. , 2018). Двойной sgRNA, нацеленный на ген кролика MC1R , был разработан в соответствии с результатом выравнивания множественных последовательностей кроликов разного цвета, и эти два целевых сайта избегали областей спонтанной делеции в гене кролика MC1R .

In vitro Транскрипция мРНК Cas9 и sgRNA

Плазмида экспрессии hSpCas9 (CMV-T7-NLS-hSpCas9-NLS) была линеаризована эндонуклеазой рестрикции Eco RI, готовящейся для транскрипции мессенджера hSpCas9 (мессенджер 9000RNA). .sgRNA с промоторной последовательностью T7 (TAATACGACTCACTATAGG) в восходящем направлении были сделаны для продукции sgRNA путем транскрипции in vitro . Матрицы, использованные для создания sgRNA, были получены с использованием праймеров, перечисленных в таблице S1. Линеаризованную плазмиду hSpCas9 и амплифицированный продукт T7-sgRNA подвергали гелевой очистке и применяли в качестве матрицы для транскрипции in vitro , соответственно, с помощью набора mMESSAGEmMACHINE ® T7 (Ambion, США) и набора MEGAshortscript ™ T7 Kit. (Ambion, США) в строгом соответствии с протоколом, рекомендованным производителем.Качество и концентрацию РНК оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле и определяли на спектрофотометре BioSpec-nano UV-Vis (Япония) соответственно. Как мРНК Cas9, так и sgRNA очищали с помощью набора для очистки транскрипции MEGAclear TM (Ambion, США), элюировали водой, не содержащей РНКаз, и замораживали при -80 ° C.

Сбор, микроинъекция и трансплантация эмбрионов

Суперовуляция была проведена у самок BR в возрасте 6-8 месяцев с использованием 1,2 мг фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) с интервалом в 12 часов шесть раз после спаривания с самцом BR и затем вводили 100-МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).Через 18 часов после инъекции ХГЧ кроличьи эмбрионы собирали на стадии пронуклеуса, промывая яйцеводы 5-мл средой для обработки ооцитов. Смесь in vitro транскрибированной мРНК Cas9 (100 нг / мкл) и sgRNA (20 нг / мкл на sgRNA) микроинъектировали в цитоплазму оплодотворенных яиц. Инъецированные зиготы переносили в среду для культивирования эмбрионов и культивировали при 38,5 ° C в 5% CO 2 в течение 5–10 мин. Затем около 14–16 инъецированных эмбрионов были аутологически трансплантированы в яйцевод кролика-донора.

Определение эффективности мутаций в бластоцистах и ​​детенышах с помощью ПЦР и секвенирования

Для проверки индел-мутаций инъецированные эмбрионы собирали на стадии бластоцисты. Геномную ДНК экстрагировали из одиночной бластоцисты с помощью буфера для лизиса клеток (Ambion) при 75 ° C в течение 15 минут и 95 ° C в течение 10 минут. Сайты-мишени sgRNA были амплифицированы с использованием высокоточной ДНК-полимеразы Golden Star T6 (TsingKe, Пекин, Китай). Праймеры ПЦР, используемые для обнаружения мутаций, были следующими: F, 5′-ACAGCCTCCCCCAGTCCT-3 ‘; R, 5’-GCACCTCCTTGAGCGTCC-3 ‘.Геномную ДНК новорожденных кроликов MC1R KO и WT экстрагировали из небольшого образца ткани уха с использованием трис-фенола / хлороформа. Праймеры MC1R -F / R использовали для генотипирования ПЦР. После очистки в геле продукты ПЦР клонировали в простой вектор pEASY-blunt (TransGen, Пекин, Китай), а затем подвергали секвенированию по Сэнгеру. Мутации были идентифицированы посредством выравнивания секвенированных аллелей с WT.

Прогнозирование модифицированной структуры белка MC1R у кроликов

MC1R KO

Для оценки влияния целевой делеции были выбраны пять основных целевых модификаций.Их 3D-модели были созданы с помощью онлайн-программы Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index). Два спонтанных аллеля белка MC1R были выбраны в качестве контроля.

Анализ вне мишени

Проверяя, представлены ли нецелевые мутации у кроликов MC1R -KO, мы спрогнозировали потенциальные нецелевые сайты (POTS) sgRNAs с помощью онлайн-инструмента CRISPR Design Tool, разработанного группой Zhang at Массачусетский технологический институт (http: // crispr.mit.edu/), и мы выбрали восемь лучших POTS для каждой sgRNA. Затем продукты ПЦР этих POTS подвергали анализу T7E1 и анализу последовательности Сэнгера. Все праймеры для нецелевого анализа перечислены в таблице S2.

Анализ расщепления T7E1

Продукты ПЦР POTS очищали в геле. Затем раствор, содержащий 5 мкл продуктов ПЦР, 1,1 мкл NEBuffer 2.1 и 4,4 мкл сверхчистой воды, инкубировали при 95 ° C в течение 10 минут, а затем отжигали при комнатной температуре в течение не менее 30 минут. После этого гибридизированные продукты ПЦР обрабатывали 5-МЕ T7E1 (NEB) в течение 30 минут при 37 ° C и, наконец, подвергали 2.Электрофорез в 5% агарозном геле.

Гистологический анализ

Кожные ткани кроликов BR и MC1R -KO фиксировали 4% параформальдегидом в течение 24 часов при 4 ° C. Возрастающие концентрации дегидратированного этанола (70% в течение 7 часов, 85% в течение 5 часов, 90% в течение 2 часов, 95% в течение 2 часов и 100% в течение 2 часов), деалкоголизированного ксилолом и залитого в парафин, были использованы для гистологическое исследование. Залитые парафином ткани, которые были разрезаны на срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и анализировали с помощью флуоресцентного инвертированного микроскопа (Nikon, Япония).Анализ интегральной оптической плотности (ИОП) гистологических срезов проводили с помощью программы Image-Pro Plus 6.0.

Количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)

Суммарную РНК экстрагировали из шкур кроликов BR, YR и MC1R -KO с помощью реагента TRIzol (Ambion, Life Technologies, США) в соответствии с протоколом производителя. затем обрабатывали ДНКазой I (Thermo Scientific, США) и подвергали обратной транскрипции в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием набора RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific).qPCR выполняли с использованием смеси ChamQ ™ Universal SYBR® qPCR Master Mix (Vazyme Biotech, Nanjing, China) с системой реального времени ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, США), и относительную экспрессию генов нормализовали до глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). ) определяли по формуле 2 — ΔΔCT . Все данные по экспрессии генов были выполнены трижды. Гены-кандидаты представляли собой фактор транскрипции, связанный с микрофтальмией ( MITF ), тирозиназу ( TYR ), родственный тирозиназе белок 1 ( TYRP1 ) и допахромтаутомеразу ( DCT ).Конкретные праймеры для КПЦР перечислены в таблице S3.

Статистика

Все количественные данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего, по крайней мере, с тремя отдельными определениями во всех экспериментах. Данные были проанализированы с помощью t -теста с использованием программы SPSS 17.0. Вероятность p <0,05 считалась статистически значимой.

Результаты

Связь

генотипов MC1R и фенотипов окраски шерсти

Клонированы отдельно 1409 п.н. (рассматриваемых как последовательность WT) гена MC1R (вся CDS 954 п.н. была амплифицирована и секвенирована, 362 п.н. 5′-нетранслируемой области и 93 п. н. 3′-нетранслируемой области) у пяти кроликов с разным окрасом шерсти, а именно BR, YR, WR, GR и CR.Последовательности, полученные из WR, CR и BR, идентифицировали присутствие делеции в 6 п.н. в рамке считывания (c.281_286del6, аллель E D ). C.304_333del30 был идентифицирован у кроликов YR и Thrianta как детерминант аллеля е. Другая делеция из 6 пар оснований, фланкированная переходом G> A в 5 ‘(c. [124G> A; 125_130del6]), существовала в японском аллеле тигрового окраса e j (рис. 1A). Ген MC1R GR был WT аллелем E, который кодировал 317 аминокислот (AA). Аллель E D , несущий WR, CR и BR, имел делецию из двух аминокислот во втором трансмембранном (TM) домене.Аллель е, принадлежащий YR и кролику Thrianta, имел делецию из 10 аминокислот в первой внеклеточной петле. А аллель японского тигрового окраса (e j ) имеет два AA в первом домене TM (рис. 1B). Эти три мутации были спонтанными.

Рисунок 1 Множественное выравнивание последовательностей гена и белковых структур кролика MC1R . (A) Выравнивание множественных экзонных последовательностей гена MC1R серого гигантского кролика (GR), новозеландского белого кролика (WR), клетчатого гигантского кролика (CR), черного кролика Ляньшань (BR), желтого кролика Фуцзянь ( YR), кролик трианта (GenBank: FN658678.1) и японского тигрового окраса (GenBank: FN658679.1). Шесть нуклеотидов в синем и зеленом прямоугольниках — это те, которые удалены в аллелях c.125-130del6 и c.281-286del6 гена кролика MC1R , соответственно. 30 нуклеотидов в красном поле — это те, которые удалены в аллелях c.304-333del30. (B) Спонтанные мутации, переносимые кроликами разных пород и окрасов шерсти. MC1R Ген GR представляет собой аллели дикого типа, которые кодируют 317 аминокислот. Две аминокислоты в синем кружке — это те, которые удалены в c.Аллель 125-130del6 (e J ), переносится японским тигровым кроликом. Две аминокислоты в зеленом кружке — это аминокислоты с делециями в аллелях c. 125-130del6 (E D ), которые переносятся WR, CR и BR. И 10 аминокислот в красном кружке — это те, которые удалены в аллелях c.304-333del30 (e), принадлежащих YR и кролику Thrianta (диаграмма аминокислотного состава зрелого белка MC1R кролика с семью трансмембранными доменами была изменена из Вольф Хоррелл и др. (2016).

Дизайн и определение эффективности sgRNA, нацеленного на кролика

MC1R Gene

С целью уничтожения MC1R в BR была разработана двойная sgRNA, нацеленная на CDS MC1R , согласно к результату множественного выравнивания последовательностей кроликов разного цвета, что позволило избежать участков естественной делеции в гене кролика MC1R (рис. 2А).Поскольку наличие спонтанных мутаций, мы не проводили анализ T7E1 в этом определении, а результаты редактирования были подтверждены анализом последовательности Сэнгера. Как показано на фиг. 2B, C, мутации были идентифицированы в шести из этих семи бластоцист (85,7%). В каждой мутировавшей бластоцисте были разные делеции длинных фрагментов. Эти результаты показали, что система CRISPR / Cas9 с двойной sgRNA эффективно нокаутировала кролика MC1R в нашем исследовании.

Рисунок 2 Делеция MC1R , направленная на двойную однонаправляющую РНК (sgRNA), в зиготах. (A) Схематическая диаграмма sgRNA, нацеленная на локусы гена MC1R кролика. Желтый прямоугольник представляет трансмембранный домен MC1R. Две последовательности sgRNA, sgRNA1 (Sg1 #) и sgRNA2 (Sg2 #), выделены зеленым. Последовательности смежных мотивов протоспейсера (PAM) представлены красным цветом с подчеркиванием. Праймеры F и R используются для обнаружения мутаций в эмбрионах. (B) Цитоплазматическая инъекция зигот с использованием системы CRISPR / Cas9. Собрано семь бластоцист. Обнаружение мутации в бластоцисте методом ПЦР.М, маркер; числа 1–7 представляют разные бластоцисты, использованные в этом исследовании. Число в красном цвете соответствует положительным эмбрионам. Шкала 100 мкм. (C) Т-клонирование и секвенирование по Сэнгеру модифицированных аллелей MC1R в бластоцистах. Последовательность дикого типа показана вверху целевой последовательности. Последовательности sgRNA отмечены зеленым, последовательности PAM — красным, вставки выделены строчными красными буквами, а делеции обозначены тире. E: эмбрионы; WT: аллель E D ; удаление: «-»; вставка: «+».

Получение

кроликов MC1R -KO с использованием системы CRISPR / Cas9

После трансплантации эмбриона и доношенной беременности две беременные кролики успешно родили девять живых детенышей (Таблица 1). MC1R Модификации не были обнаружены у семи детенышей от материнского кролика № 1, но все два других детеныша от материнского кролика № 3 имели мутировавший ген MC1R . Как и ожидалось, делеции больших фрагментов гена MC1R присутствовали у этих двух детенышей, пронумерованных Y31 и Y32, и Y31 имел одну последовательность WT, а именно аллель e, по сравнению с BR, но Y32 не имел (Фигуры 3B, C). Как показано на рисунке 3A, в естественных условиях у чернокожих родителей мужского и женского пола с гетерозиготным генотипом (E D / e) будут детеныши трех окрасов: черного (B15), желтого (Y11) и белого ( W12). Интересно, что кролики MC1R -KO Y31 и Y32 показали новый красивый окрас шерсти, бледно-желтый, который отчетливо отличался от дикого желтого. И мы обнаружили, что два кролика-основателя несли несколько мутантных генотипов, от делеции 10 пар оснований до делеции более 700 пар оснований. Поскольку удаленный фрагмент слишком длинный и включает спонтанные делеции длиной 6 и 30 пар оснований, невозможно было узнать исходный генотип и исходный цвет шерсти Y32.Но одно можно было сказать наверняка: Y31 сначала нес аллель E D , что означало, что он изначально был черным, и этот черный цвет шерсти был изменен на бледно-желтый посредством редактирования гена . В совокупности мы успешно сгенерировали кроликов MC1R -KO с новым цветом шерсти с использованием CRISPR / Cas9.

Таблица 1 Сводка по кроликам MC1R -нокаут (KO), полученным с помощью CRISPR / Cas9.

Рис. 3 Поколение кроликов MC1R -нокаута (KO) с новым цветом шерсти с использованием системы CRISPR / Cas9. (A) Фотографии кроликов MC1R -KO в возрасте 6 месяцев, сделанные с помощью системы CRISPR / Cas9; кролик В15, черный; кролик W12, белый; кролик Y11, желтый; и кролики Y31 и Y32, бледно-желтые. Y31 — самка кролика, а Y32 — самец. (B) Мутацию определяли у кроликов-основателей с помощью ПЦР. М, маркер; 1, Y31; 2, Y32; 3, Y11; 4, W12; 5, W13; 6, W14; 7, В15; 8, В16; и 9, B17. Число в красном цвете представляет мутировавших детенышей MC1R . (C) Т-клонирование и секвенирование по Сэнгеру у девяти детенышей с модифицированными аллелями MC1R .Два аллеля E D и e родительских черных кроликов Lianshan (BR) показаны в верхней части целевой последовательности. Самопроизвольные удаления обозначены черными черточками, а соответствующие неудаленные основания показаны синим цветом. Последовательности однонаправляющих РНК (sgRNA) отмечены зеленым, сайты смежных мотивов протоспейсера (PAM) выделены красным, вставки выделены строчными красными буквами, а делеции обозначены зелеными штрихами. Удаление: «-».

Характеристика деструктивных модификаций кроликов

MC1R -KO

Посредством анализа секвенирования было обнаружено два типа модификаций MC1R , обнаруженных в Y31, и четыре типа в Y32.Поскольку есть участие спонтанной делеции 6 пар оснований, обозначенной как D 6 (c.281_286del6), и делеции 30 пар оснований, обозначенной как D 30 (c.304_333del30) в MC1R CDS, для более интуитивного отображения мы генотипировали все модификации двух кроликов-мишеней с помощью делеций D 6 или D 30 по сравнению с BR (D означает делецию и N неделецию). Предыдущие исследования показали, что спонтанные мутации D 6 N 30 , а именно аллель E D , преобладали у черного кролика, а аллель N 6 D 30 , а именно аллель е, был рецессивным красно-желтым. (Fontanesi et al., 2006). Итак, генотип черного был E D / -, а желтого — ее. Как показано на фиг. 4A, генотип Y31 был E D / e, а генотип Y32 был — / e, оба из которых являются неопределенными, поскольку все две спонтанные мутации были делециями. Таким образом, было очевидно, что цвет шерсти Y31 был изменен с черного на бледно-желтый с помощью системы CRISPR / Cas9 . Дальнейший анализ показал, что, за исключением четвертого модифицированного типа Y32, который был удален слишком долго, чтобы иметь стартовый кодон, все остальные модификации привели к сдвигу рамки считывания и преждевременному стоп-кодону и, как следствие, к усеченному белку MC1R. что может полностью или частично отменить функцию MC1R.Результат предсказания структуры белка показал, что преждевременное прерывание вызвало отсутствие большинства структур TM, которые были важны для функции MC1R (Рисунок 4B). Можно сделать вывод, что события нацеливания привели к нарушению функции MC1R.

Рисунок 4 Диаграмма спонтанных делеций (D 6 N 30 или N 6 D 30 ) и прогнозирование белковой структуры однонаправленных (sgRNA) / Cas9 целевых модификаций двух MC1R -нокаутных (КО) кроликов. (A) «D 6 » обозначается как спонтанная делеция (по сравнению с N 6 как неделеция) с делецией длиной 6 п.о. ниже стартового кодона ATG. «D 30 » обозначается как спонтанная делеция (по сравнению с N 30 как неделеция) с делецией 30 пар оснований ниже D 6 . Целевые модификации CRISPR / Cas9 проиллюстрированы отдельно на диаграмме выше и ниже спонтанной делеции, которая показывает формы модификаций и предсказанные белковые продукты преждевременного стоп-кодона аминокислот.Последовательности sgRNA отмечены зеленым, сайты PAM — красным, а делеции — зелеными штрихами. (B) Построение моделей MC1R E D в соответствии с пятью модификациями и двумя типами WT BR. WT D 6 , структура аллеля MC1R E D ; WT D 30 , структура аллеля MC1R e; Y31 m1, тип редактирования −4 и −39 п.н .; Y31 м2, тип редактирования −278 или 302 п.н .; Y32 m1, тип редактирования −10 п. н .; Y32 м2, вид редактирования −28 п.н .; Y32 м3, вид редактирования −7 и −6 п.н.

Обнаружение нецелевых у кроликов

MC1R -KO

Чтобы определить, присутствовали ли мутации, не соответствующие цели у кроликов MC1R -KO, мы спрогнозировали POTS двух sgRNA с помощью онлайн-инструмента CRISPR Design Tool, разработанного и выбрали восемь верхних POTS для каждой sgRNA. Результаты анализа T7E1 и анализа последовательности Сэнгера показали, что ни одна из нецелевых мутаций не была обнаружена в этих POTS у кроликов MC1R -KO (Фигуры 5A, B). Информация о POTS была перечислена в Таблице S2.

Рис. 5 Обнаружение отклонения от цели у кроликов MC1R -нокаут (KO). (A) ПЦР и T7E1 анализы восьми основных потенциальных нецелевых сайтов (POTS) для Sg1 # и Sg2 #, соответственно. В анализах T7E1 фрагментов не обнаружено. (B) Анализ последовательности хроматограмм 16 POTS для Sg1 # и Sg2 # с использованием продуктов ПЦР в основателях. Никакой двойной кривой не было показано ни на одной из диаграмм секвенирования. Горшки подчеркнуты красным.

Оценка фенотипа кроликов

MC1R -KO и анализ сигнального пути

Результаты гистологического окрашивания H&E показали, что количества эумеланина не присутствовали в волосяных фолликулах кроликов MC1R -KO по сравнению с BR (рис. 6A).И гистограмма показала, что IOD гистологических срезов кроликов KO был значительно ниже, чем у BR (Рисунок 6B). Мы также исследовали, приводит ли нарушение MC1R к снижению экспрессии нижележащего гена сигнального пути MC1R (рис. 6D) в ткани кожи. Как показано на рисунке 6C, уровни мРНК гена MITF , TYR , TYRP1 и DCT были значительно снижены у кроликов MC1R -KO по сравнению с контрольной группой BR.Эти результаты также показывают, что потеря функции белка MC1R способствовала блокированию синтеза эумеланина и создавала новый цвет шерсти у кроликов MC1R -KO.

Рисунок 6 Идентификация фенотипа и экспрессия нижестоящих генов в сигнальном пути MC1R кроликов MC1R -KO. (A) Окрашивание кожи H&E кроликов BR и KO. BR — черный кролик Ляньшань; H&E, гематоксилин и эозин; КО, MC1R — кролики-нокауты.Шкала 100 мкм для 400 ×. (B) Анализ интегральной оптической плотности (IOD) гистологических срезов с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus. (C) Относительную экспрессию генов MITF , TYR , TYRP1 и DCT определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Гистограммы показывают средние значения. Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку (SE). (D) Взаимосвязь MITF , TYR , TYRP1 и DCT в пути меланогенеза.Гены с зеленой рамкой значительно подавлены в коже KO по сравнению с кожей BR. BR — черный кролик Ляньшань; YR, желтый кролик провинции Фуцзянь; КО, MC1R -КО кролик. * 0,01 < p <0,05; ** p <0,01 (схема пути меланогенеза была упрощена из базы данных путей KEGG, 04916, 23. 10.15, Kanchisa Laboratories).

Обсуждение

MC1R состоит из семи α-спиральных (TM) доменов с мотивом DRY на стыке третьего домена TM, внутриклеточного C-конца, связанного с сайтом пальмитоилирования, и внеклеточного N-конца, присоединенного к N -связанный сайт гликозилирования, как и другие рецепторы, связанные с G-белком (GPCR) (Yang, 2011).Внеклеточный N-концевой хвост выполняет следующие функции: (1) сродство к лиганду (Chhajlani et al., 1996) и (2) знаковый якорь (Wallin and von Heijne, 1995; Garcia-Borron et al., 2005). Существует консервативный остаток цистеина, присутствующий на N-конце соединения и в первом TM-домене, который полностью необходим для функции рецептора (Frandberg et al., 2001). С-конец в GPCR часто играет роль в переносе белков из эндоплазматического ретикулума на плазматическую мембрану (Schulein et al., 1998; Qanbar and Bouvier, 2003), а также во взаимодействии рецепторов с белком G на плазматической мембране (Strader et al., 1994). Предыдущие исследования продемонстрировали, что мутации, которые прерывают пентапептид или, особенно, вариант трипептида, такие как преждевременная терминация по R306 (Newton et al. , 2000) или удаление концевого пентапептида (Sanchez-Mas et al., 2005), приводят к минимальному количеству плазмы. мембранная экспрессия MC1R. поскольку внеклеточные петли MC1R соединяются с лигандами, мутации в этой области влияют на сродство связывания (Chhajlani et al., 1996). Сходным образом внутриклеточные петли mc1r играют жизненно важную роль в связывании белка Gs. Таким образом, любая потеря функции из-за мутаций гена MC1R может повлиять на сигнальный путь MC1R и вмешаться в меланогенез.

Аллель WT E гена кролика MC1R имеет 317 AA, а фенотип окраса шерсти нормальный серый, как у GR. Аллели E D и E S удаляют два AA во втором домене TM (c.280_285del6) и приводят к преобладанию черного и стального цветов покрытия соответственно (Fontanesi et al., 2006). Следовательно, черные породы, такие как BR, безусловно, несут этот доминантный аллель (E D / E D или E D /−). Рецессивный аллель удаляет 10 AA первой внеклеточной петли (c. 304_333del30) и находился в гомозиготное состояние у всех красных / желтых кроликов, таких как породы Тюрингия и YR (Fontanesi et al., 2006). В нашем исследовании результат секвенирования CDS полного гена MC1R GR, WR, CR, BR и YR соответствовал предыдущим отчетам. Разумно предположить, что ген MC1R -KO BR будет давать желтый фенотип.

В попытке выяснить, соответствует ли фенотип, продуцируемый искусственно модифицированным геном MC1R , фенотипу спонтанной мутации потери функции, ген MC1R стал мишенью для системы CRISPR / Cas9. Путем совместной инъекции sgRNA и мРНК Cas9 в зиготы кроликов мы получили двух кроликов MC1R -KO нового цвета шерсти. Секвенирование по Сэнгеру показало, что делеция в гене MC1R кроликов-основателей варьировала от 10 до более чем 700 п.н.Модель MC1R -KO у млекопитающих была представлена ​​впервые. По сравнению с диким желтым кроликом цвет шерсти кроликов MC1R -KO был явно светлее (рис. 3А). Стоит отметить, что в потомстве кроме черных и желтых кроликов были получены белые кролики, и все белые кролики несли доминантный черный аллель E D (Рисунок 3C). У кроликов белый окрас шерсти контролируется локусом C, который кодирует ген Tyrosinase ( Tyr ), а не локусом E, кодирующим MC1R (Aigner et al., 2000). Предыдущие исследования показали, что TYR является ограничивающим скорость ферментом, катализирующим меланогенез, и играет ключевую роль в биосинтезе меланина и альбинизме (Симеонов и др., 2013). Мутировавший ген Tyr привел к отсутствию пигментации из-за дефицита продукции меланина. Мы предположили, что родительские кролики несли гетерозиготную мутацию Tyr , и на фенотип альбинизма не влиял нокаут MC1R или нет.

Чтобы проанализировать исходные генотипы кроликов MC1R -KO, мы также идентифицировали генотипы MC1R родительских кроликов.Все генотипы родителей были E D / e, а потомство от материнского кролика № 1 показало три ожидаемых генотипа. Один из двух кроликов MC1R -KO не мог быть определен из-за делеций очень больших фрагментов в гене MC1R , но другой, изначально несущий доминантный черный аллель E D , был подтвержден. Из-за особенности негомологичного соединения концов (NHEJ), вызванной CRISPR / Cas9, аллели редактировались случайным образом и могут иметь разные модификации для каждого аллеля.У кроликов MC1R -KO было шесть типов модификаций, которые приводили к сдвигу рамки и преждевременному завершению, и даже часть последовательностей интронов была даже удалена. Основываясь на предсказании белка с помощью трехмерной модели, все преждевременные терминации, следовательно, приводили к усечению белка, и все пять усеченных белков не содержали по крайней мере половины ТМ-доменов. Что касается двух спонтанных мутантных белков, D 30 лишен двух β-поворотов по сравнению с белком D 6 . β-Повороты играют жизненно важную роль в белках, что позволяет изменять направление полипептида в отношении фолдинга белка и молекулярного распознавания (Rose et al. , 1985). Из-за того, что белок, кодируемый аллелем е, не имеет двух β-поворотов в первой внеклеточной петле, это влияет на распознавание MC1R лигандами; таким образом, была нарушена активация пути производства эумеланина. Разумно предположить, что разрушение TM-доменов и полного C-концевого домена, продуцируемого KO гена MC1R , разрушило структуру рецептора в большей степени, что привело к большему количеству функциональных дефектов MC1R.

MC1R участвует в синтезе меланина, связываясь с двумя лигандами: α-MSH и ASIP (Choudhary et al., 2016). Комбинация α-MSH с MC1R активирует систему аденилатциклазы, увеличивает уровень циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), а затем способствует синтезу эумеланина и ингибирует выход феомеланина, тогда как связывание ASIP с MC1R снижает конститутивную передачу сигналов в Путь цАМФ, который приводит к снижению выработки эумеланина и увеличению выхода феомеланина, таким образом регулируя изменение цвета шерсти (Le Pape et al., 2008; Le Pape et al. , 2009). В качестве нижестоящих генов пути MC1R / cAMP MITF (Steingrimsson et al., 2004; Levy et al., 2006), TYR (Wang and Hebert, 2006; Ando et al., 2007), TYRP1 (del Marmol and Beermann, 1996; Lai et al., 2018) и DCT ( Aroca et al., 1992; Guyonneau et al., 2004) гены были очень важны в пути меланогенеза (рис. 6D). Мы продемонстрировали, что путь MC1R / cAMP был нарушен, а дисфункциональный MC1R приводит к разной степени снижения экспрессии этих генов у кроликов MC1R -KO по сравнению с диким желтым кроликом (рис. 6C).Этот результат разумно объяснил светло-желтый фенотип кроликов MC1R -KO на молекулярном уровне.

Заключение

Таким образом, новый бледно-желтый цвет шерсти у кроликов MC1R -KO был получен путем прерывания гена MC1R в BR с помощью системы CRISPR / Cas9. Наша работа продемонстрировала, что ген MC1R кролика играет жизненно важную роль в определении цвета шерсти, а нарушение гена MC1R изменит цвет шерсти. Кролики, редактирующие ген, с новым окрасом шерсти могут быть использованы в качестве модели для дальнейшего изучения механизмов функции гена MC1R . Кроме того, наше исследование заложило основу использования системы CRISPR / Cas9 для искусственного получения животных с популярными или новыми цветами шерсти.

Доступность данных

Все наборы данных для этого исследования включены в рукопись и дополнительные файлы.

Заявление об этике

Кроликов, использованных в настоящем исследовании, регулярно кормили в Центре лабораторных животных Университета Гуанси.Все экспериментальные исследования были одобрены и рассмотрены Комитетом по уходу и использованию экспериментальных животных Университета Гуанси (код разрешения: GXU2019-029). В настоящем исследовании эксперимент на кроликах проводился в соответствии с Основным руководством по использованию лабораторных животных и уходу за ними.

Вклад авторов

NX, DS и QL разработали и разработали эксперименты. NX, HL, SZ, XS и YZ проводили эксперименты. NX проанализировал данные, а LS написал рукопись. KC отредактировал рукопись.Все авторы прочитали и одобрили окончательную версию рукописи.

Финансирование

Настоящее исследование было предоставлено и поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (гранты № 31772597 и 31860638), и мы также благодарны Фонду естественных наук Гуанси (гранты № AA17204051 и AB16380042).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарны за техническую поддержку Государственной ключевой лаборатории по сохранению и использованию субтропических агробиоресурсов. Мы также благодарим Центр лабораторных животных Университета Гуанси за предоставление экспериментальных кроликов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www. frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2019.00875/full#supplementary-material

Ссылки

Ando, ​​H., Кондо, Х., Ичихаши, М., Слух, В. Дж. (2007). Подходы к идентификации ингибиторов биосинтеза меланина через контроль качества тирозиназы. Журнал следственной дерматологии 127 (4), 751–761. doi: 10.1038 / sj.jid.5700683

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Aroca, P., Solano, F., Salinas, C., Garcia-Borron, J. C., Lozano, J. A. (1992). Регуляция финальной фазы меланогенеза у млекопитающих. Роль дофахромовой таутомеразы и соотношение между 5,6-дигидроксииндол-2-карбоновой кислотой и 5,6-дигидроксииндолом. евро. J. Pharmacol. 208 (1), 155–163. doi: 10.1111 / j.1432-1033.1992.tb17169.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chhajlani, V., Xu, X., Blauw, J., Sudarshi., S. (1996). Идентификация остатков связывания лиганда во внеклеточных петлях рецептора меланокортина 1. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 219 (2), 521–525. doi: 10.1006 / bbrc.1996.0266

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Choudhary, R., Kumar, S., Сингх, С. В., Шарма, А. К., Гоуд, Т. С., Шривастава, А. К., и др. (2016). Проверка предполагаемых эталонных генов для исследований экспрессии генов в клетках меланоцитов Bos indicus, подвергнутых тепловому стрессу и обработанных альфа-МСГ, с использованием количественной ПЦР в реальном времени. Мол. Сотовые зонды. 30 (3), 161–167. doi: 10.1016 / j.mcp.2016.03.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Cone, R. D., Lu, D. S., Koppula, S., Vage, D. I., Klungland, H., Boston, B., et al. (1996).«Рецепторы меланокортина: агонисты, антагонисты и гормональный контроль пигментации», в Последние достижения в исследованиях гормонов , том. 51. Под ред. Конн, П. М. (Chevy Chase: Endocrine Soc), 287–318. Материалы конференции 1995 г.

Google Scholar

Эвертс, Р. Э., Ротуйзен, Дж., Ван Ост, Б. А. (2000). Выявление преждевременного стоп-кодона в гене рецептора меланоцит-стимулирующего гормона (MC1R) у лабрадоров и золотистых ретриверов с желтой окраской шерсти. Anim. Genet. 31 (3), 194–199. doi: 10.1046 / j.1365-2052.2000.00639.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fontanesi, L., Beretti, F., Riggio, V., Dall’Olio, S., Gonzalez, E.G., Finocchiaro, R., et al. (2009). Миссенс и нонсенс мутации в гене рецептора меланокортина 1 (MC1R) у разных пород коз: связь с фенотипами красного и черного окраса шерсти, но с неожиданными доказательствами. BMC Genet. 10, 47. doi: 10.1186 / 1471-2156-10-47

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fontanesi, L., Таццоли, М., Беретти, Ф., Руссо, В. (2006). Мутации в гене рецептора меланокортина 1 (MC1R) связаны с окрасом шерсти домашнего кролика (Oryctolagus cuniculus). Anim. Genet. 37 (5), 489–493. doi: 10.1111 / j.1365-2052.2006.01494.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fox, R. R. (1994). «Таксономия и генетика», в Биология лабораторного кролика , 2-е изд. Ред. Мэннинг, П. Дж., Ринглер, Д. Х., Новичок, К. Э.(Сан-Диего: Academic Press), 1-26.

Google Scholar

Frandberg, P. A., Doufexis, M., Kapas, S., Chhajlani, V. (2001). Остатки цистеина участвуют в структуре и функции рецептора меланокортина 1: замена остатка цистеина во втором трансмембранном сегменте превращает агонист в антагонист. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 281 (4), 851–857. doi: 10.1006 / bbrc.2001.4429

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гарсия-Боррон, Дж.К., Санчес-Лаорден, Б. Л., Хименес-Сервантес, К. (2005). Структура рецептора меланокортина-1 и функциональная регуляция. Pigment Cell Res. 18 (6), 393–410. doi: 10.1111 / j.1600-0749.2005.00278.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Guyonneau, L., Murisier, F., Rossier, A., Moulin, A., Beermann, F. (2004). У мышей с нокаутом дофахромовой таутомеразы затрагиваются меланоциты и пигментация. Мол. Cell Biol. 24 (8), 3396–3403. DOI: 10.1128 / MCB.24.8.3396-3403.2004

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Joerg, H., Fries, H.R., Meijerink, E., Stranzinger, G.F. (1996). Красный цвет шерсти крупного рогатого скота голштинской породы связан с делецией в гене MSHR. Мамм. Геном 7 (4), 317–318. doi: 10.1007 / s0033590

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Kerje, S., Lind, J., Schutz, K., Jensen, P., Andersson, L. (2003). Мутации рецептора меланокортина 1 (MC1R) связаны с цветом оперения у кур. Anim. Genet. 34 (4), 241–248. DOI: 10.1046 / j.1365-2052.2003.00991.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Kijas, J. M., Moller, M., Plastow, G., Andersson, L. (2001). Мутация сдвига рамки считывания в MC1R и высокая частота соматических реверсий вызывают появление черных пятен у свиней. Генетика 158 (2), 779–785. doi: 10.1017 / S0016672301005043

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Киджас, Дж. М., Уэльс, Р., Торнстен, А., Шардон, П., Моллер, М., Андерссон, Л. (1998). Мутации рецептора меланокортина 1 (MC1R) и цвет шерсти у свиней. Генетика 150 (3), 1177–1185.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Klungland, H., Vage, D. I., Gomez-Raya, L., Adalsteinsson, S., Lien, S. (1995). Роль рецептора меланоцитстимулирующего гормона (МСГ) в определении цвета шерсти крупного рогатого скота. Мамм. Геном 6 (9), 636–639. doi: 10.1007 / BF00352371

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lai, X.Л., Уичерс, Х. Дж., Солер-Лопес, М., Дейкстра, Б. В. (2018). Структура и функция тирозиназы человека и белков, связанных с тирозиназой. Химия 24 (1), 47–55. doi: 10.1002 / chem.201704410

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Le Pape, E., Passeron, T., Giubellino, A., Valencia, J. C., Wolber, R., Hearing, V.J. (2009). Анализ микроматрицы проливает свет на дедифференцирующую роль сигнального белка агути в мышиных меланоцитах через Mc1r. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 106 (6), 1802–1807. doi: 10.1073 / pnas.0806753106

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Le Pape, E., Wakamatsu, K., Ito, S., Wolber, R., Hearing, V.J. (2008). Регулирование синтеза эумеланина / феомеланина и видимой пигментации в меланоцитах лигандами рецептора меланокортина 1. Pigment Cell Melanoma Res. 21 (4), 477–486. doi: 10.1111 / j.1755-148X.2008.00479.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Леви, К., Халед, М., Фишер, Д. Э. (2006). MITF: главный регулятор развития меланоцитов и онкогена меланомы. Trends Mol. Med. 12 (9), 406–414. doi: 10.1016 / j.molmed.2006.07.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lu, D., Willard, D., Patel, I. R., Kadwell, S., Overton, L., Kost, T., et al. (1994). Белок агути является антагонистом рецептора меланоцит-стимулирующего гормона. Природа 371 (6500), 799–802. doi: 10.1038 / 371799a0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Марклунд, Л. , Моллер, М. Дж., Сандберг, К., Андерссон, Л. (1996). Миссенс-мутация в гене рецептора меланоцит-стимулирующего гормона (MC1R) связана с каштановым окрасом шерсти у лошадей. Мамм. Геном 7 (12), 895–899. doi: 10.1007 / s0033594

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ньютон, Дж. М., Уилки, А. Л., Хе, Л., Джордан, С. А., Металлинос, Д. Л., Холмс, Н. Г. и др. (2000). Вариации рецептора меланокортина 1 у домашней собаки. Мамм.Геном 11 (1), 24–30. doi: 10.1007 / s003350010005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Оллманн, М. М., Ламоре, М. Л., Уилсон, Б. Д., Барш, Г. С. (1998). Взаимодействие белка агути с рецептором меланокортина 1 in vitro и in vivo . Genes Dev. 12 (3), 316–330. doi: 10.1101 / gad.12.3.316

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Qanbar, R., Bouvier, M. (2003). Роль реакций пальмитоилирования / депальмитоилирования в функции рецепторов, связанных с G-белками. Pharmacol. Ther. 97 (1), 1–33. doi: 10.1016 / S0163-7258 (02) 00300-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Роббинс, Л. С., Надо, Дж. Х., Джонсон, К. Р., Келли, М. А., Розелли-Рехфус, Л., Баак, Э. и др. (1993). Фенотипы пигментации аллелей вариантного локуса расширения являются результатом точечных мутаций, которые изменяют функцию рецептора MSH. Ячейка 72 (6), 827–834. doi: 10.1016 / 0092-8674 (93)

-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Робинсон, Р.(1958). «Генетические исследования кролика», в Генетические исследования кролика . Гаага, Голландия: Мартинус Нийхофф.

Google Scholar

Rouzaud, F., Martin, J., Gallet, P.F., Delourme, D., Goulemot-Leger, V., Amigues, Y., et al. (2000). Первый анализ генотипирования французских пород крупного рогатого скота на основе нового аллеля гена удлинения, кодирующего рецептор меланокортина-1 (Mc1r). Genet. Sel. Evol. 32 (5), 511–520. doi: 10.1051 / gse: 2000102

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Sanchez-Mas, J., Санчес-Лаорден, Б. Л., Гильо, Л. А., Хименес-Сервантес, К., Гарсия-Боррон, Дж. К. (2005). Карбоксил-концевой пентапептид рецептора меланокортина-1 необходим для функции и экспрессии MC1R на поверхности клетки. Пептиды 26 (10), 1848–1857. doi: 10.1016 / j.peptides.2004.11.030

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schulein, R., Hermosilla, R., Oksche, A., Dehe, M., Wiesner, B., Krause, G., et al. (1998). Дилейциновая последовательность и предшествующий глутаматный остаток на внутриклеточном карбоксильном конце рецептора вазопрессина V2 важны для транспорта на клеточной поверхности при COS.Клетки M6. Мол. Pharmacol. 54 (3), 525–535. doi: 10.1124 / mol.54.3.525

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Симеонов Д. Р., Ван X., Ван К., Сергеев Ю., Долинска М., Бауэр М. и др. (2013). Вариации ДНК при кожно-кожном альбинизме: обновленный список мутаций и текущие нерешенные вопросы молекулярной диагностики. Hum. Мутат. 34 (6), 827–835. doi: 10.1002 / humu.22315

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Steingrimsson, E., Коупленд, Н.Г., Дженкинс, Н.А. (2004). Меланоциты и сеть факторов транскрипции микрофтальмии. Annu. Преподобный Жене. 38, 365–411. doi: 10.1146 / annurev.genet.38.072902.092717

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Strader, C. D., Fong, T. M., Tota, M. R., Underwood, D., Dixon, R.A. (1994). Структура и функция рецепторов, связанных с G-белком. Annu. Rev. Biochem. 63, 101–132. doi: 10.1146 / annurev.bi.63.070194.000533

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Su, X., Цуй, К., Ду, С., Ли, Х., Лу, Ф., Ши, Д. и др. (2018). Эффективное редактирование генома в культивируемых клетках и эмбрионах свиньи Дебао и болотного буйвола с помощью системы CRISPR / Cas9. In vitro Cell Dev. Биол. Anim. 54 (5), 375–383. doi: 10.1007 / s11626-018-0236-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Vage, D. I., Fuglei, E., Snipstad, K., Beheim, J., Landsem, V. M., Klungland, H. (2005). Две замены цистеина в MC1R генерируют синий вариант песца (Alopex lagopus) и предотвращают экспрессию белой зимней шерсти. Пептиды 26 (10), 1814–1817. doi: 10.1016 / j.peptides.2004.11.040

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Vage, D. I., Klungland, H., Lu, D., Cone, R. D. (1999). Молекулярная и фармакологическая характеристика доминирующего черного окраса шерсти у овец. Мамм. Геном 10 (1), 39–43. doi: 10.1007 / s003359

9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Vage, D. I., Lu, D., Klungland, H., Lien, S., Adalsteinsson, S., Конус, Р. Д. (1997). Неэпистатическое взаимодействие агути и разгибания у лисиц Vulpes vulpes. Нац. Genet. 15 (3), 311–315. doi: 10.1038 / ng0397-311

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вальверде, П., Хили, Э., Джексон, И., Рис, Дж. Л., Тоди, А. Дж. (1995). Варианты гена рецептора меланоцит-стимулирующего гормона связаны с рыжими волосами и светлой кожей у людей. Нац. Genet. 11 (3), 328–330. DOI: 10.1038 / ng1195-328

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wang, N., Хеберт, Д. Н. (2006). Созревание тирозиназы через секреторный путь млекопитающих: оживление цвета. Pigment Cell Res. 19 (1), 3–18. doi: 10.1111 / j.1600-0749.2005.00288.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Наследование рисунков окраски шерсти у собак — ScienceDaily

Международная группа исследователей, в которую входят ученые из Института генетики Университета Берна, разгадала загадку наследования рисунков окраски шерсти у собак.Исследователи обнаружили, что генетический вариант, ответственный за очень светлую шерсть у собак и волков, произошел более двух миллионов лет назад от ныне вымершего родственника современного волка.

Наследование нескольких моделей окраса шерсти у собак вызывает споры на протяжении десятилетий. Исследователи, в том числе Тоссо Лееб из Института генетики Бернского университета, наконец, смогли решить загадку. Они не только прояснили, как генетически контролируются образцы окраски шерсти, но и обнаружили, что светлая окраска шерсти белых арктических волков и многих современных собак связана с генетическим вариантом, происходящим от вида, который давно вымер.Исследование только что было опубликовано в научном журнале

Nature Ecology and Evolution .

Два пигмента и «переключатель» для всех цветов пальто

Волки и собаки могут вырабатывать два разных типа пигмента: черный, называемый эумеланином, и желтый, феомеланин. Точно регулируемое производство этих двух пигментов в нужное время и в нужном месте на теле дает начало очень разным цветам шерсти. Перед исследованием у собак были выявлены четыре различных паттерна и было выдвинуто предположение о нескольких генетических вариантах, которые вызывают эти паттерны.Однако коммерческое генетическое тестирование этих вариантов на многих тысячах собак дало противоречивые результаты, указывая на то, что существующие знания о наследовании окраски шерсти были неполными и не совсем правильными.

Во время формирования цвета шерсти так называемый сигнальный белок агути представляет собой главный выключатель организма для производства желтого феомеланина. Если присутствует сигнальный белок агути, клетки, продуцирующие пигмент, будут синтезировать желтый феомеланин.Если сигнальный белок агути отсутствует, образуется черный эумеланин. «Мы рано поняли, что причинные генетические варианты должны быть регуляторными вариантами, которые модулируют скорость продукции белка и приводят к увеличению или уменьшению количества сигнального белка агути», — объясняет Тоссо Лееб.

Пять вместо четырех различных окрасов шерсти

Ген сигнального белка агути имеет несколько сайтов инициации чтения генетической информации, которые называются промоторами.У собак, с одной стороны, есть вентральный промотор, который отвечает за выработку сигнального белка агути на животе. С другой стороны, у собак есть дополнительный промотор, специфичный для цикла роста волос, который опосредует выработку сигнального белка агути на определенных стадиях роста волос и способствует образованию полосатых волос.

Впервые исследователи подробно охарактеризовали этих двух промоторов у сотен собак. Они обнаружили два варианта вентрального промотора.Один из вариантов обеспечивает производство нормального количества сигнального белка агути. Другой вариант имеет более высокую активность и вызывает производство повышенного количества сигнального белка агути. Исследователи даже идентифицировали три различных варианта промотора, специфичного для цикла роста волос. Начиная с этих вариантов у отдельных промоторов, исследователи определили в общей сложности пять различных комбинаций, которые вызывают различный цвет шерсти у собак. «Учебники должны быть переписаны, так как их пять вместо ранее принятых четырех разных паттернов у собак», — говорит Либ.

Неожиданные выводы об эволюции волков

Поскольку многие геномы волков из разных регионов Земли стали общедоступными, исследователи дополнительно исследовали, существуют ли идентифицированные генетические варианты также у волков. Эти анализы показали, что варианты сверхактивных вентральных и специфичных для волосяного цикла промоторов уже присутствовали у волков до приручения современных собак, которое началось примерно 40 000 лет назад.Скорее всего, эти генетические варианты способствовали адаптации волков с более светлым окрасом шерсти к снежной среде в прошлые ледниковые периоды. Сегодня полностью белые арктические волки и светлые волки в Гималаях все еще несут эти генетические варианты.

Дальнейшие сравнения последовательностей генов с другими видами семейства canidae дали очень неожиданные результаты. Исследователи смогли показать, что сверхактивный вариант промотора, специфичного для цикла шерсти, у собак и волков светлого окраса имел больше сходств с очень далекими родственными видами, такими как золотой шакал или койот, чем с европейским серым волком.

«Единственное правдоподобное объяснение этой неожиданной находки — это древнее происхождение этого варианта, более двух миллионов лет назад, от ныне вымершего родственника волков», — говорит Либ. Сегмент гена, должно быть, был внедрен более двух миллионов лет назад в волков в результате событий гибридизации с этим ныне вымершим родственником волков. Таким образом, небольшая часть ДНК этого вымершего вида до сих пор обнаруживается у желтых собак и белых арктических волков. «Это напоминает захватывающее открытие, что современные люди несут в своих геномах небольшую часть ДНК от ныне вымерших неандертальцев», — добавляет Либ.

Исследование было проведено благодаря творческому отпуску профессора Даники Баннаш из Бернского университета, который давно занимается изучением генетики окраски шерсти домашних животных. Баннаш, профессор ветеринарной генетики из Калифорнийского университета в Дэвисе, отфильтровал соответствующие варианты промоторов из тысяч других функционально нейтральных генетических вариантов. Эволюционный анализ был проведен Кристофером Кэлином и Грегори Баршем из Института Гудзон-Альфа и Стэнфордского университета.

Исследование финансировалось грантами Швейцарского национального научного фонда SNSF, фондов кафедры Максин Адлер, фонда Джейн и Аатоса Эркко и Академии Финляндии.

Изменение окраски шерсти овец из-за нарушения гена ASIP с помощью CRISPR Cas9

Этическое заявление

Животные, использованные в этом исследовании, регулярно содержались в Исследовательской базе овцеводства Синьцзянской академии зоотехники. Операции проводились в строгих асептических условиях, и были предприняты усилия, чтобы минимизировать страдания животных.Все процедуры обращения с животными выполнялись в строгом соответствии с утвержденными руководящими принципами Института ухода за животными Синьцзянской академии зоотехники (идентификатор утверждения: 2016ZX08010-004-009).

Дизайн sgRNA

sgRNA, нацеленная на ген ASIP овец, была разработана онлайн-программой (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/reannotate_crispr.html) на основе последовательности экзона 2 длиной 169 пар оснований (GenBank: NM_001134303.1). Схематическая структура гена ASIP овцы и схема конструкции sgRNA представлены на рис.1А. Нецелевой эффект был предсказан программой в данных генома Ovis aries Oar_v3. 1.

Получение мРНК Cas9 и sgRNA

Соответствующие олигонуклеотиды заказывали в ShangHai Sangon Biotech Corporation. Парные синтезированные олигонуклеотиды ( ASIP -sgRNA-CF / CR, таблица S2) для получения sgRNA отжигали и фосфорилировали следующим образом. Первоначально использовали 1 мкл смысловых олигонуклеотидов, 1 мкл антисмысловых олигонуклеотидов, 2 мкл 10-кратного буфера для отжига, 2 мкл АТФ (10 мМ), 1 мкл полинуклеотидкиназы Т4 и 13 мкл ddH 2 O. перемешивали при 37 ° C в течение 30 минут, инкубировали при 95 ° C в течение 5 минут и охлаждали при комнатной температуре.Между тем, бицистронный вектор экспрессии pX330 (Addgene, Кембридж, Массачусетс, США), который использовали для экспрессии Cas9 и sgRNA, был линеаризован с помощью BbsI , обработанного CIP (щелочная кишечная фосфатаза теленка, NEB, Беверли, Массачусетс, США). , и гель очищен. Затем фосфорилированный олигонуклеотид был субклонирован в линеаризованный вектор pX330, содержащий две кассеты экспрессии, человеческий Streptococcus pyogenes ( hSpy ) Cas9 и химерную gRNA, тем самым составив рекомбинантный вектор для получения Cas9 и sgRNA in vitro с помощью . .

Для продукции sgRNA посредством транскрипции in vitro , промоторная последовательность T7 (TAATACGACTCACTATAGG) была добавлена ​​выше sgRNA, а на 5′-конце последовательности sgRNA были добавлены два нуклеотида G для оптимальной транскрипции. Праймеры, использованные при приготовлении матрицы для транскрипции in vitro , перечислены в таблице S2 ( ASIP -sgRNA-TF / TR). Реакция ПЦР включала 25 мкл PrimeSTAR Max Premix, 0,5 мкл каждого олигонуклеотида T7-sgRNA (10 мкМ), 50 нг рекомбинантного вектора и ddH 2 O до конечного объема 50 мкл.Затем смесь прогоняли в термоциклере в условиях 95 ° C в течение 5 мин; 35 циклов 98 ° C в течение 10 с, 55 ° C в течение 15 с, 72 ° C в течение 5 с; и заключительный при 72 ° C в течение 10 мин. Амплифицированный продукт T7-sgRNA подвергали очистке в геле (Qiagen, Франкфурт, Гессен, Германия) и использовали в качестве матрицы для транскрипции in vitro с помощью набора для транскрипции MEGAshortscript TM T7 (Ambion, Остин, Техас, США).

Трехнуклеотидный спейсер (AGA) и промотор Т7 добавляли к 5′-фланкирующей области кодирования Cas9 с помощью ПЦР с праймерами Cas9 F / R (таблица S2) и с px330 в качестве матрицы.Амплифицированный продукт ПЦР T7-Cas9 очищали в геле и использовали в качестве матрицы для транскрипции in vitro с помощью набора для транскрипции mMESSAGE mMACHINE® T7 ULTRA (Ambion, США). После транскрипции добавление поли (A) хвоста и обработка ДНКазой I выполняли в соответствии с инструкциями производителя для мРНК, кодирующей Cas9.

Как мРНК Cas9, так и цгРНК очищали с использованием набора для очистки транскрипции MEGAclear TM (Ambion, США), элюировали водой, свободной от РНКазы, и замораживали при -80 ° C.Спектрофотометр Nanodrop использовался для проверки чистоты и измерения концентраций. Качество РНК дополнительно проверяли с помощью гель-электрофореза.

Получение генно-модифицированной овцы путем инъекции Cas9 / sgRNA в зиготу.

Ген-модифицированная овца была получена путем микроинъекции смеси 100 нг / мкл мРНК Cas9 и 50 нг / мкл sgRNA в цитоплазму зигот. Зиготы овец собирали с помощью хирургической промывки яйцевода от доноров путем синхронизации течки и обработки суперовуляции, как описано с небольшими модификациями 18, 19 .Вкратце, доноры получали лечение CIDR (прогестерон 300 мг) в течение 12 дней во влагалище. Суперовуляторное лечение проводилось путем введения 240 мг oFSH (овечьего фолликулостимулирующего гормона, sansheng) шести пациентам с уменьшающимся внутримышечным сокращением. дозы каждые 12 ч (50 мг × 2, 40 мг × 2 и 30 мг × 2), начиная с 3 дня после обнаружения течки (день 0). Удаление пробки и введение однократной дозы в / м. 0,1 мг клопростенола (саньшэн) проводилось при завершении пятой инъекции ФСГ. После удаления plog овец тестировали для определения начала течки путем визуального наблюдения дважды в день (8:00 и 20:00) с введением вазэктомированного барана на 30 мин.Если у овцематок была течка, выполнялась инъекция 200 мг ЛГ (саньшэн).

Зиготы овец (примерно через 20 часов после оплодотворения) собирали хирургическим путем и немедленно переносили в среду SOF с 3 мг / мл BSA. Затем зиготы подвергали цитоплазматической микроинъекции смесью Cas9 / sgRNA. После инъекции зиготы культивировали в культуральной среде in vitro [SOF с добавлением 3 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA)] в течение 24 часов при 38,6 ° C, 5% CO 2 , пока они не разделились на 2-4 клетки.

В качестве реципиентов было выбрано 68 овец в возрасте 2–4 лет с регулярными циклами течки. При переносе эмбрионов реципиенты были синхронизированы с помощью той же обработки, что и донорские овцы. Делящиеся зародыши переносили в ампульно-перешейковое соединение яйцевода реципиентов. После 60-й трансплантации беременность определена на УЗИ.

Анализ на основе ПЦР

Для анализа событий редактирования были взяты образцы ткани хвоста ягненка, геномная ДНК была извлечена из лизата измельченной ткани фенол-хлороформом и выделена осаждением спиртом.ДНК с равным количеством (300 нг) использовали в качестве матрицы для амплификации ПЦР с помощью праймеров ( ASIP — F / R, таблица S2) в соответствии со следующей программой: 95 ° C в течение 5 минут, затем 95 ° C в течение 30 секунд, 61 ° C в течение 30 секунд, 72 ° C 45 секунд, и завершение 72 ° C в течение 7 минут после 35 циклов.

Анализ расщепления T7EI

Анализ расщепления эндонуклеазой I T7 (T7EI) выполняли, как описано 20 . Вкратце, целевые фрагменты амплифицировали из экстрагированной ДНК с помощью ДНК-полимеразы Taq (BBI, Торонто, Канада).Около 200 нг продукта ПЦР для каждого образца денатурировали и повторно отжигали для образования гетеродуплексов в буфере 2 NEB (NEB, Беверли, Массачусетс, США), используя следующие настройки программы: 95 ° C в течение 10 минут, 95 ° C – 85 ° C при — Падение на 2 ° C / с, затем падение на 85–25 ° C при –0,3 ° C / с, выдержка при 25 ° C в течение 1 мин и, наконец, при 10 ° C. После повторного отжига продукты обрабатывали 0,2 мкл T7EI (NEB, США) и инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин. Затем расщепленный продукт ПЦР подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле.

Секвенирование ДНК гена-мишени

Для проверки индел-мутаций продукты ПЦР секвенировали напрямую (использованные праймеры перечислены в таблице S2) для подтверждения наличия событий редактирования.Пики с перекрывающимися пиками затем субклонировали в вектор pMD-19T (TakaRa, Япония) для секвенирования. Для каждого образца случайным образом выбирали не менее 20 колоний и секвенировали их с использованием праймера M13. Мутации идентифицировали путем сопоставления секвенированных аллелей с диким типом.

Миссенс-мутация в PMEL17 связана с серебристым окрасом шерсти лошади | BMC Genomic Data

  • 1.

    Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J: Пигментация меланина в коже млекопитающих и ее гормональная регуляция.Physiol Rev.2004, 84: 1155-228. 10.1152 / Physrev.00044.2003.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 2.

    Bowling A: Генетика цветовых вариаций. Генетика лошади. Отредактировано: Bowling AT, Рувинский А. 2000, Нью-Йорк: CABI Publishing, 62-

    Chapter Google ученый

  • 3.

    Voisey J, van Daal A: Агути: от мыши к человеку, от кожи до жира.Pigment Cell Res. 2002, 15: 10-18. 10.1034 / j.1600-0749.2002.00039.x.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 4.

    Марклунд Л., Моллер М.Дж., Сандберг К., Андерссон Л.: Миссенс-мутация в гене рецептора меланоцит-стимулирующего гормона (MC1R) связана с каштановым цветом шерсти у лошадей. Геном мамм. 1996, 7: 895-9. 10.1007 / s0033594.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 5.

    Квон Б.С., Халабан Р., Поннажаган С., Ким К., Чинтаманени С., Беннетт Д., Пикард Р.Т .: Мутация мышиного серебра вызывается вставкой одного основания в предполагаемый цитоплазматический домен Pmel 17. Nucleic Acids Res. 1995, 23: 154-8.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 6.

    Мартинес Эспарса М., Хименес Сервантес С., Беннетт, округ Колумбия, Лосано, Лос-Анджелес, Солано Ф, Гарсия-Боррон JC: Локус Silver мыши кодирует один транскрипт, усеченный мутацией Silver.Геном мамм. 1999, 10: 1168-71. 10.1007 / s0033594.

    PubMed Статья Google ученый

  • 7.

    Kerje S, Sharma P, Gunnarsson U, Kim H, Bagchi S, Fredriksson R, Schutz K, Jensen P, von Heijne G, Okimoto R, Andersson L: доминирующий белый, серовато-коричневый и дымчатый варианты цветов в цыпленок связаны с полиморфизмом вставок / делеций в гене PMEL17. Генетика. 2004, 168: 1507-18. 10.1534 / genetics.104.027995.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 8.

    Schonthaler HB, Lampert JM, von Lintig J, Schwarz H, Geisler R, Neuhauss SC: Мутация в гене серебра приводит к дефектам биогенеза меланосом и изменениям в зрительной системе у мутантов данио-рерио с затухающим зрением. Dev Biol. 2005, 284: 421-36.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 9.

    Clark LA, Wahl JM, Rees CA, Murphy KE: Вставка ретротранспозона в SILV отвечает за формирование паттерна мерля у домашней собаки.Proc Natl Acad Sci USA. 2006, 103: 1376-81. 10.1073 / pnas.0506940103.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 10.

    Theos AC, Truschel ST, Raposo G, Marks MS: Продукт серебряного локуса Pmel17 / gp100 / Silv / ME20: противоречивый по названию и по функциям. Pigment Cell Res. 2005, 18: 322-36. 10.1111 / j.1600-0749.2005.00269.x.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 11.

    Стивенс FJ: Образование амилоида: эмуляция сборки белков матрикса ?. Амилоид. 2004, 11: 232-44.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 12.

    Фаулер Д.М., Кулов А.В., Алори-Йост С., Маркс М.С., Балч В.Е., Келли Дж.В.: Функциональное образование амилоида в тканях млекопитающих. PLoS Biol. 2006, 4: e6-10.1371 / journal.pbio.0040006.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 13.

    Baxter LL, Pavan WJ: Экспрессия Pmel17 является Mitf-зависимой и выявляет миграцию краниальных меланобластов во время развития мышей. Паттерны экспрессии генов. 2003, 3: 703-7. 10.1016 / j.modgep.2003.07.002.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 14.

    Kwon BS, Chintamaneni C, Kozak CA, Copeland NG, Gilbert DJ, Jenkins N, Barton D, Francke U, Kobayachi Y, Kim KK: ген, специфичный для меланоцитов, Pmel17, отображается около серебристого цвета шерсти. локус на хромосоме 10 мыши и находится в синтенической области на хромосоме 12 человека.Proc Natl Acad Sci USA. 1991, 88: 9228-32. 10.1073 / pnas.88.20.9228.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 15.

    Penedo MCT, Millon LV, Bernoco D, Bailey E, Binns M, Cholewinski G, Ellis N, Flynn J, Gralak B, Guthrie A, Lindgren G, Lyons LA, Tozaki T, Røed K, Swinburne J : Отчет о международном семинаре по картированию генов лошадей: исчерпывающая карта связей, построенная с использованием данных новых маркеров и объединения четырех картографических ресурсов.Цитогенетика и исследования генома. 2005, 111: 5-15. 10.1159 / 000085664.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 16.

    Green P, Falls KA, Crooks S: Документация для CRI-MAP, версия 2.4. 1990, Медицинский факультет Вашингтонского университета, Сент-Луиза, Миссури

    Google ученый

  • 17.

    Rieder S: Angewandte, vergleichende Genetik am Beispiel des Melanoms beim Pferd.Кандидатская диссертация. 1999, Высшая техническая школа в Цюрихе,

    Google ученый

  • 18.

    RepeatMasker. [http://www.repeatmasker.org/]

  • 19.

    Браузер генома UCSC. [http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway]

  • 20.

    Theos AC, Berson JF, Theos SC, Herman KE, Harper DC, Tenza D, Sviderskaya EV, Lamoreux ML, Bennett DC, Рапосо Дж., Маркс МС: двойная потеря ER-экспорта и эндоцитарных сигналов с измененной морфологией меланосом в серебряной мутации Pmel17.Mol Biol Cell. 2006, 17 (8): 3598-612. 10.1091 / mbc.E06-01-0081.

    PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 21.

    Steingrimsson E, Copeland NG, Jenkins NA: Меланоциты и сеть факторов транскрипции микрофтальмии. Анну Рев Жене. 2004, 38: 365-411. 10.1146 / annurev.genet.38.072902.092717.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 22.

    Ramsey DT, Ewart SL, Render JA, Cook CS, Latimer CA: Врожденные аномалии глаз у лошадей Скалистых гор. Вет офтальмол. 1999, 2: 47-59. 10.1046 / j.1463-5224.1999.00050.x.

    PubMed Статья Google ученый

  • 23.

    Ewart SL, Ramsey DT, Xu J, Meyers D: Лошадиный гомолог врожденной анизидии соответствует кодоминантному наследованию. J Hered. 2000, 91: 93-8. 10.1093 / jhered / 91.2.93.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 24.

    Гелатт К.Н., МакГилл Л.Д.: Клинические характеристики микрофтальмии с колобомами австралийской овчарки. J Am Vet Med Assoc. 1973, 162: 393-6.

    PubMed CAS Google ученый

  • 25.

    Sponenberg DP: Генетика окраса лошадей. 2003, Айова Государственная пресса Айовы

    Google ученый

  • 26.

    Катлер Т.Дж., Брукс Д.Е., Эндрю С.Е., Денис Х.М., Бирос Д.Д., Гелатт К.Н., Комароми А.М., Каллберг М. Болезнь заднего сегмента лошади.Вет офтальмол. 2000, 3: 73.82-10.1046 / j.1463-5224.2000.00138.x.

    PubMed Статья Google ученый

  • 27.

    Parichy DM, Turner JM: Временные и клеточные потребности для передачи сигналов Fms во время развития пигментного паттерна взрослых рыбок данио. Разработка. 2003, 130: 817-33. 10.1242 / dev.00307.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 28.

    Хирата М., Накамура К., Канемару Т., Шибата Ю., Кондо С.: Организация пигментных клеток в гиподерме рыбок данио.Dev Dyn. 2003, 227: 497-503. 10.1002 / dvdy.10334.

    PubMed Статья Google ученый

  • 29.

    Хирата М., Накамура К., Кондо С. Распределение пигментных клеток в различных тканях рыбок данио, с особым упором на полосатый рисунок пигмента. Dev Dyn. 2005, 234: 293-300. 10.1002 / dvdy.20513.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 30.

    Меллгрен Е.М., Джонсон С.Л.: Эволюция морфологической сложности полос рыбок данио.Тенденции Genet. 2002, 18: 128-34. 10.1016 / S0168-9525 (01) 02614-2.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 31.

    Куигли И.К., Мануэль Дж.Л., Робертс Р.А., Накелс Р.Дж., Херрингтон Э.Р., Макдональд Е.Л., Паричи Д.М. Эволюционная диверсификация пигментного рисунка у рыб данио: дифференциальная зависимость от fms и потеря полос у D. albolineatus. Разработка. 2005, 132: 89-104. 10.1242 / dev.01547.

    PubMed CAS Статья Google ученый

  • 32.

    Линдгрен Г., Сандберг К., Перссон Х., Марклунд С., Брин М., Сандгрен Б., Карлстен Дж., Эллегрен Х .: Карта аутосомных сцеплений самцов генома лошади. Геномные исследования. 1998, 8: 951-966.

    PubMed CAS PubMed Central Google ученый

  • 33.

    Rieder S, Stricker C, Joerg H, Dummer R, Stranzinger G: сравнительный генетический подход к исследованию стареющей меланомы серой лошади. J Anim Breed Genet. 2000, 117: 73-82. 10.1046 / j.1439-0388.2000.00245.x.

    Артикул Google ученый

  • 34.

    База данных архива трассировки NCBI. [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/mmtrace.shtml]

  • 35.

    Pielberg G, Olsson C, Syvanen AC, Andersson L: Неожиданно высокое аллельное разнообразие в локусе KIT, вызывающее доминантный белый окрас домашней свиньи. Генетика. 2002, 160: 305-11.

    PubMed CAS PubMed Central Google ученый

  • Варианты локуса ASIP способствуют потемнению цвета шерсти у крупного рогатого скота породы Неллор | Genetics Selection Evolution

  • 1.

    ABIEC — Associação Brasileira das Indústrias Exportadoras de Carnes. Estatísticas. http://abiec.com.br/. По состоянию на 18 ноября 2020 г.

  • 2.

    Ajmone-Marsan P, Garcia JF, Lenstra JA, The Globaldiv Consortium. О происхождении крупного рогатого скота: как зубры стали скотом и колонизировали мир. Evol Anthropol. 2010; 19: 148–57.

    Артикул Google ученый

  • 3.

    Karthickeyan SMK, Kumarasamy P, Sivaselvam SN, Saravanan R, Thangaraju P.Анализ микросателлитных маркеров онгольской породы крупного рогатого скота. Индийский J Biotechnol. 2008; 7: 113–6.

    Google ученый

  • 4.

    Фадаре А.О., Петерс С.О., Якубу А., Сонибаре А.О., Аделеке М.А., Озодже МО и др. Физиологические и гематологические показатели свидетельствуют о превосходной термостойкости белых западноафриканских карликовых овец в жарких влажных тропиках. Trop Anim Health Prod. 2013; 45: 157–65.

    PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 5.

    Leite JHGM, Silva RG, da Silva WST, da Silva WE, Paiva RDM, Sousa JER и др. Приспособленные к местным условиям бразильские овцы с разным окрасом шерсти поддерживают теплоту в течение года в экваториальной полузасушливой среде. Int J Biometeorol. 2018; 62: 1635–44.

    PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 6.

    Да Силва Р.Г., Ла Скала Дж. Н., Тонхати Х. Излучательные свойства кожи и шерсти крупного рогатого скота и других животных.Trans ASAE. 2003; 46: 913–8.

    Google ученый

  • 7.

    Fonseca VO, Souza CF, Azevedo NA, Oliveira LZ, Monteiro GA, Cavalcanti LFL, et al. Репродуктивные показатели быков породы Nelore, выращенных на пастбищах ( Bos taurus indicus ) в разном возрасте. Arq Bras Med Vet Zootec. 2019; 71: 385–92.

    Артикул Google ученый

  • 8.

    Decker JE, McKay SD, Rolf MM, Kim JW, Molina Alcala A, Sonstegard TS, et al.Мировые закономерности происхождения, расхождения и смешения домашних животных. PLoS Genet. 2014; 10: e1004254.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 9.

    Барбато М., Хейлер Ф., Упадхьяй М., Дель Корво М., Колли Л., Негрини Р. и др. Адаптивная интрогрессия индицинового крупного рогатого скота в белые породы крупного рогатого скота из Центральной Италии. Научный доклад 2020; 101: 1279.

    Артикул CAS Google ученый

  • 10.

    Сенчук Г., Герра Л., Мастранджело С., Кампобассо С., Зубейда К., Имане М. и др. Пятнадцать оттенков серого: комбинированный анализ данных SNP по всему геному у степного и средиземноморского серого крупного рогатого скота проливает новый свет на молекулярную основу цвета шерсти. Гены. 2020; 11: 932.

    CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 11.

    Rosen BD, Bickhart DM, Schnabel RD, Koren S, Elsik CG, Tseng E, et al. De novo Сборка эталонного генома крупного рогатого скота с помощью одномолекулярного секвенирования.GigaScience. 2020; 9: giaa021.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 12.

    Голландия PW. Идентификация участков генома крупного рогатого скота, связанных с серым окрасом шерсти в популяции скрещивания Неллор-Ангус. Магистерская диссертация, Техасский университет A&M. 2015.

  • 13.

    Карвалейро Р., Бойсон С.А., Невес ХХР, Сарголзаи М., Шенкель Ф.С., Уцуномия Ю.Т. и др. Точность вменения генотипа крупного рогатого скота породы Нелор.Genet Sel Evol. 2014; 46: 69.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 14.

    Utsunomiya YT, Milanesi M, Utsunomiya ATH, Torrecilha RBP, Kim ES, Costa MS, et al. Мутация PLAG1 способствовала восстановлению роста современного крупного рогатого скота. Научный отчет 2017; 7: 17140.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 15.

    Перселл С., Нил Б., Тодд-Браун К., Томас Л., Феррейра М.А., Бендер Д. и др. PLINK: набор инструментов для полногеномного анализа ассоциаций и популяционного анализа сцепления. Am J Hum Genet. 2007. 81: 559–75.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 16.

    Чанг С.К., Чоу С.К., Теллиер Л.К., Ваттикути С., Перселл С.М., Ли Дж.Дж. PLINK второго поколения: ответ на вызов более крупных и богатых наборов данных. Gigascience.2015; 4: 7.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 17.

    Ян Дж., Ли С.Х., Годдард М.Э., Вишер П.М. GCTA: инструмент для анализа сложных признаков в масштабе всего генома. Am J Hum Genet. 2011; 88: 76–82.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 18.

    Ян Дж., Зейтлен Н.А., Годдард М.Э., Вишер П.М., Прайс А.Л. Преимущества и недостатки применения методов ассоциации смешанных моделей.Нат Жене. 2014; 46: 100–6.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 19.

    R Основная группа. R: язык и среда для статистических вычислений. Вена: Фонд R для статистических вычислений; 2020. https://www.R-project.org/.

  • 20.

    Falconer DS, Mackay TFC. Введение в количественную генетику. 4-е изд. Харлоу: Longman Group Limited; 1996. с. 464.

    Google ученый

  • 21.

    Витезика З.Г., Варона Л., Легарра А. Об аддитивной и доминантной дисперсии и ковариации индивидов в рамках геномной селекции. Генетика. 2013; 195: 1223–30.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 22.

    Loh P-R, Danecek P, Palamara PF, Fuchsberger C, Reshef YA, Finucane HK, et al. Фазирование на основе эталонов с использованием панели Консорциума эталонных гаплотипов. Нат Жене. 2016; 48: 1443–8.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 23.

    Utsunomiya YT, Milanesi M, Utsunomiya ATH, Ajmone-Marsan P, Garcia JF. GHap: пакет R для гаплотипирования всего генома. Биоинформатика. 2016; 32: 2861–2.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 24.

    Li H, Durbin R. Быстрое и точное согласование коротких считываний с помощью преобразования Барроуза – Уиллера. Биоинформатика. 2009; 251: 1754–60.

    Артикул CAS Google ученый

  • 25.

    Ли Х, Хандакер Б., Вайсокер А, Феннелл Т., Руан Дж., Гомер Н. и др. Формат выравнивания / карты последовательностей и SAMtools. Биоинформатика. 2009; 25: 2078–9.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 26.

    McLaren W., Gil L, Hunt SE, Riat HS, Ritchie GR, Thormann A, et al. Предиктор эффекта варианта Ensembl. Genome Biol. 2016; 17: 122.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 27.

    Wang X, Zheng Z, Yudong C, Chen T, Li C, Fu W и др. CNVCaller: высокоэффективное и широко применяемое программное обеспечение для обнаружения вариаций числа копий в больших популяциях. GigaScience. 2017; 6: 1–12.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 28.

    Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): высокопроизводительная визуализация и исследование данных геномики. Краткий биоинформ.2013; 14: 178–92.

    PubMed Статья CAS PubMed Central Google ученый

  • 29.

    Heng L. Minimap2: попарное выравнивание нуклеотидных последовательностей. Биоинформатика. 2018; 34: 3094–100.

    Артикул CAS Google ученый

  • 30.

    Girardot M, Martin J, Guibert S, Leveziel H, Julien R, Oulmouden A. Широко распространенная экспрессия гена коровьего Agouti является результатом по меньшей мере трех альтернативных промоторов.Pigment Cell Res. 2005; 18: 34–41.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 31.

    Girardot M, Guibert S, Laforet MP, Gallard Y, Larroque H, Oulmouden A. Вставка полноразмерного элемента Bos taurus LINE отвечает за дерегуляцию транскрипции гена Normande Agouti. Pigment Cell Res. 2006; 19: 346–55.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 32.

    Альбрехт Э., Комолка К., Кузински Дж., Маак С. Повторный визит Агути: количественная оценка транскрипта гена ASIP в тканях крупного рогатого скота, связанная с экспрессией и локализацией белка. PLoS One. 2012; 7: e35282.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 33.

    Лю Й., Фанг Х, Чжао З., Ли Дж., Альбрехт Э., Шеринг Л. и др. Полиморфизмы гена ASIP и гаплотипа связаны с особенностями отложения жира и составом жирных кислот у китайских бычков симментальской породы.Arch Anim Breed. 2019; 62: 135–42.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 34.

    Альберс П.К., Маквин Г. Датирование геномных вариантов и общего происхождения в данных секвенирования в масштабе популяции. PLoS Biol. 2020; 18: e3000586.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 35.

    Zavarez LB, Utsunomiya YT, Carmo AS, Neves HHR, Carvalheiro R, Ferencakovic M, et al.Оценка аутозиготности коров Nellore ( Bos indicus ) с помощью генотипов SNP с высокой плотностью. Фронт Жене. 2015; 6: 5.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 36.

    Lan JH, Yin Y, Reed EF, Moua K, Thomas K, Zhang Q. Влияние трех методов построения библиотеки Illumina на систематическую ошибку GC и определение генотипа HLA. Hum Immunol. 2015; 76: 166–75.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 37.

    Rieder S, Taourit S, Mariat D, Langlois B, Guérin G. Мутации в локусах агути ( ASIP ), удлинении ( MC1R ) и коричневом ( TYRP1 ) локусах и их связь с фенотипами окраски шерсти в лошадях ( Equus caballus ). Геном мамм. 2001; 12: 450–5.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 38.

    Хирагаки Т., Иноуэ-Мураяма М., Мива М., Фудзивара А., Мизутани М., Минвиэль Ф. и др.Рецессивный черный является аллелем локуса желтого оперения у японского перепела и связан с делецией сдвига рамки считывания в гене ASIP . Генетика. 2008; 178: 771–5.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 39.

    Лай В., Ху М., Чжу В., Ю Ф, Бай С., Чжан Дж. И др. Делеция 4 п.н. в гене ASIP связана с рецессивным черным окрасом шерсти домашних морских свинок ( Cavia porcellus ).Anim Genet. 2019; 50: 190–1.

    PubMed Статья Google ученый

  • 40.

    Летко А., Амманн Б., Джаганнатан В., Хенкель Дж., Лойтхард Ф., Шеллинг С. и др. Делеция, охватывающая промотор и первый экзон изоформы транскрипта ASIP , специфичной для цикла волос, у черно-подпалых кроликов. Anim Genet. 2019; 51: 137–40.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 41.

    Барш Г., Ганн Т., Хе Л., Шлоссман С., Дюк-Кохан Дж. Биохимические и генетические исследования переключения пигментного типа. Pigment Cell Res. 2000; 13: 48–53.

    PubMed Статья Google ученый

  • 42.

    Cieslak M, Reissmann M, Hofreiter M, Ludwig A. Цвета одомашнивания. Биол Рев Камб Филос Соц. 2011; 86: 885–99.

    PubMed Статья Google ученый

  • 43.

    Chen Y, Duhl DMJ, Barsh G. Противоположные ориентации инвертированной дупликации и аллельной вариации в локусе agouti мыши. Генетика. 1996; 144: 265–77.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 44.

    Норрис Б.Дж., Ван Вирджиния. Дупликация гена, влияющая на экспрессию гена ASIP овцы, ответственна за белых и черных овец. Genome Res. 2008; 18: 1282–93.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 45.

    Фонтанези Л., Беретти Ф., Риджио В., Гомес Гонсалес Е., Далл’Олио С., Даволи Р. и др. Вариация числа копий и миссенс-мутации гена сигнального белка агути ( ASIP ) у пород коз с разным окрасом шерсти. Cytogenet Genome Res. 2009; 126: 333–47.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 46.

    Хенкель Дж., Саиф Р., Джаганнатан В., Шмокер С., Цайндлер Ф., Бангертер Э. и др.Селекционные сигнатуры у коз выявляют варианты количества копий, лежащие в основе фенотипов окраса шерсти, определяющих породу. PLoS Genet. 2019; 15: e1008536.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 47.

    Робик А., Мориссон М., Леру С., Гуришон Д., Виньял А., Тибо Н. и др. Две новые структурные мутации в 5′-области гена ASIP вызывают фенотип ослабления окраски перьев у японских перепелов. Genet Sel Evol.2019; 51: 12.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 48.

    Demars J, Cano M, Drouilhet L, Plisson-Petit F, Bardou P, Fabre S, et al. Полногеномная идентификация мутации, лежащей в основе вариации шерсти, и отличия предков волосатых видов от современных шерстистых овец. Mol Biol Evol. 2017; 34: 1722–9.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 49.

    Liang D, Zhao P, Si J, Fang L, Pairo-Castineira E, Hu X и ​​др. Геномный анализ выявил конвергентную эволюцию LINE-1 в окраске шерсти: тематическое исследование на водяных буйволах ( Bubalus bubalis ). Mol Biol Evol. 2021; 38: 1122–36.

    PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • Цвет пальто | Zoetis US

    Тестирование может помочь определить цвет шерсти.

    • Большинство производителей молочной продукции, работающих с голштинским скотом, знают, что порода бывает двух цветов — черно-белой или красно-белой.
    • Хотя визуально определить фенотип коровы просто, генетика окраса шерсти голштинской породы сложна, и многие возможные генотипы определяют внешний вид животного.
    • Есть два разных места в геноме голштинской породы, которые влияют на цвет шерсти. Одно место влияет на рецессивный красный цвет шерсти и форму черно-красного цвета, а другое влияет на доминирующий красный цвет.
    • Рецессивный красный, наиболее распространенная форма красной окраски шерсти у крупного рогатого скота голштинской породы, находится в другой части генома, чем доминирующий красный — это разные условия, которые влияют на признак окраски шерсти. Генетические тесты доступны для обоих мест.

    Тест на цвет шерсти при заказе CLARIFIDE
    ®
    • Результаты включают информацию о генотипе для информации о рецессивном красном и доминирующем красном и используют информацию о гаплотипе для черного / красного.
    • Производители, желающие увеличить количество красных животных в своем стаде, могут использовать результаты для определения тех животных, которые могут быть носителями.
    • После идентификации эти животные могут участвовать в программах спаривания для размножения соответствующих генов красного окраса шерсти.

    Щелкните здесь, чтобы просмотреть другие материалы, доступные в центре ресурсов Zoetis Genetics.

    Пожалуйста, следуйте этим инструкциям и руководствам, чтобы разместить у нас свой заказ.

    ПЕРВЫЙ КЛИЕНТ?

    Впервые в Zoetis Genetics? Пожалуйста, позвоните нам по телефону 877-233-3362, и мы расскажем вам о доступных вариантах.

    МЕЖДУНАРОДНЫЙ ЗАКАЗ

    Пожалуйста, свяжитесь с нашей службой поддержки клиентов по телефону 877-233-3362 или [email protected], чтобы убедиться, что наши лаборатории одобрены для проведения тестов ДНК в вашей стране.

    СБОР ДНК

    Заказать Сборщики ДНК

    производителей голштинской породы, использующие Enlight , могут заказать тестовые сборщики в Enlight на сайте www.enlightdairy.com.

    Посмотреть образцы видео из коллекции

    Сбор высококачественного образца — это первый шаг к получению точных геномных результатов. Узнайте больше здесь.

    Часто задаваемые вопросы

    Здесь вы найдете ответы на общие вопросы о процессе заказа Zoetis Genetics. Если проблема не исчезнет, ​​свяжитесь с нами по телефону 877-233-3362, и мы будем рады помочь.

    ОТПРАВИТЬ ФОРМУ И ОБРАЗЦЫ

    Отправьте свой заказ и образцы набора для тестирования по электронной почте по адресу:

    Zoetis Genetics
    333 Portage Street, Building 300
    Kalamazoo, MI 49007-9970

    Отправьте заполненную форму по электронной почте на номер:

    генетика[email protected]

    Щелкните здесь, чтобы просмотреть расписание подачи образцов и отчетов для клиентов.

    Исследования

    показывают взаимосвязь между цветом волчьей шерсти и здоровьем

    Серые волки имеют различную окраску шерсти (серый, белый, черный, подпал и т. Д.), Но новое исследование показывает, что, по крайней мере, для волков в Йеллоустонском национальном парке, цвет шерсти имеет удивительную связь с общим состоянием здоровья.Волки с черной шерстью имели более высокую выживаемость при воздействии чумы собак, чем волки с серой шерстью, наряду с высоким репродуктивным успехом и другими показателями жизнеспособности.

    Исследование, проведенное биологами Йеллоустоуна в партнерстве с Калифорнийским университетом в Лос-Анджелесе, основывалось на технологии CRISPR для анализа культур клеток, полученных от диких волков Йеллоустоуна. Исследователи представили собачью чуму клеточным культурам в попытке узнать, как черные и серые волки реагируют на болезнь; предварительные результаты показывают, что реакция зависит от цвета шерсти.

    Цвет шерсти определяется, по крайней мере, тремя разными генами, каждый из которых состоит из пары, и ген может относиться к серому или черному окрасу шерсти. Ген черной окраски шерсти является доминирующим, что означает, что в паре с геном серой окраски волк будет иметь черную внешнюю шерсть, а не серую. Волки Йеллоустоуна с двумя генами серой окраски шерсти являются гомозиготными серыми (55% популяции), волки с двумя генами черной окраски шерсти — гомозиготными черными (3% популяции), а волки с одним геном серой и одной черной окраски шерсти являются гетерозиготными. черный (42% населения).

    Проанализировав два десятилетия истории жизни волков, исследователи обнаружили, что гетерозиготные черные волки имели гораздо более высокие показатели выживаемости и воспроизводимости, чем их гомозиготные черные собратья, и даже были немного выше, чем гетерозиготные серые волки. Однако после изучения многолетней репродуктивной истории они обнаружили, что у серых самок выживаемость помета на 25% выше, чем у черных.

    LEAVE A RESPONSE

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *