Цвет пальто: Непромокаемое ветрозащитное пальто цвет слоновой кости цвет

Содержание

Цвет и фактура ткани пальто

Колористическому оформлению предметов гардероба придается сегодня большое значение. Этому в большой степени поспособствовали ученые-психологи, объясняющие влияние того или иного оттенка на восприятие предмета человеком, эмоциональное состояние и даже на здоровье. Свои коррективы вносит Ее Величество Мода благодаря ежесезонной публикации таблиц ведущих цветов. Но есть еще личные предпочтения и вкусы, касающиеся не только расцветок и тонов, но и фактур материалов, которые также влияют на наши взгляды и отношения к изделиям швейной промышленности. Что это означает применительно к пальто, рассмотрим подробнее.

Гладкость или лохматость?

Разнообразие пальтовых тканей по виду лицевой поверхности очень велико, и каждый год производятся новые их виды. Популярность ворсованных полотен, таких как кашемир, пальтовый бархат, драп с начесом объясняется хорошими теплозащитными свойствами, ведь подсознательно мы понимаем, что воздух в порах и между ворсинок является барьером для холода.

Благодаря такому спросу основой ассортимента в магазинах пальто становятся изделия из этих материалов.

Но, в последнее время, набрала вес тенденция использования для зимней и осенней одежды тканей с гладким, скользким и блестящим видом, как правило, тонких. Для выполнения основной функции в пальто из них используется утепляющая прокладка, состоящая из пухового пакета или синтепона. Сам основной материал только внешне имеет сходство с болоньей. Качество новинок выше, надежность в носке больше. Особенно радует скатывание капелек влаги, из-за чего изделие становится неуязвимым для дождя и мокрого снега.

Эти два пограничных вида поверхности – ворсованный и гладкий – имеют свои достоинства и недостатки. Так «пушистые» пальто выглядят уютнее, но менее практичны в носке и немного полнят. Плащевка и болонья хорошо сохраняют цвет и очень современны, спортивны и энергичны. Но они не гарантируют изделию интеллигентного и дорогого налета, свойственного кашемировым тканям, а блеск, опять же, создает ощущение избыточного объема.

Осторожно с цветом

Каталоги пальто все чаще начинают пестреть яркими оттенками и радужными переливами. Так мода реагирует на унылость осенних и зимних дней. Но любителям выделиться нужно помнить о простейших правилах, накладываемых цветом на любые изделия, в том числе, зимнюю и осеннюю одежду. Они всем известны, но все же: темные цвета стройнят, светлые – визуально расширяют силуэты; притененные оттенки более элегантны при общих условиях, нежели чистые и насыщенные; теплые тона добавляют несколько сантиметров к обхватам по сравнению с холодными.

В общей композиции пальто-шарф-шапка-сапоги-сумочка не желательно использовать более чем 3-4 цвета, даже при условии их хорошей сочетаемости. Идеально, если в костюме только одно яркое притягательное для глаз пятно, и оно не отвлекает от лица «модели».

Крупный рисунок, например, клетка или горох на пальто, может оказать плохую услугу как излишне полным, так и миниатюрным дамам. Вертикальные полосы стройнят, горизонтальные — полнят, комбинации из наклонных скрывают истинные пропорции.

Манипулирование цветом пальто интересно тем, что в зависимости от оттенка крупного шарфа или высокой обуви могут создаваться различные эффекты контрастов: насыщенности, размеров, холодного и теплого, светлого и темного. Примеряя получаемые варианты на себя, необходимо найти свое сочетание – то, при котором лицо будет смотреться наиболее выигрышно.

Золотая середина

Профессионалы, работающие в домах моды и на фабриках пальто, научились использовать слабые и сильные стороны цветов и фактур в одном изделии. Во-первых, разные материалы или их тона используются для основных деталей и для несущих отделочно-декоративную функцию: воротников, манжет, пелерин, клапанов. Это позволяет в некоторой степени удешевить изделие, ведь более шикарной ткани нужно меньше, а ее красота используется на полную.

Другой вариант состоит в комбинировании разных тканей на основных деталях. Например, коротковорсовый искусственный мех может ставиться на верхнюю часть рукава, а нижняя выполняется из простого драпа. Тем самым уменьшают свойлачиваемость ворса в зонах возникновения трения при носке. Изящество фигуры повышают, выполняя центральные части переда и спинки из боле светлых или ярких тканей, а боковые из темных или тусклых.

Таких приемов, находящихся в арсенале модельеров, достаточно много. Чтобы их заметить, нужно лишь немного внимания.

Цвет и фактура материала являются такими же неотъемлемыми атрибутами модели, как крой, длина, качество посадки на фигуре. Неудачный их выбор может свести на нет старания целой группы специалистов, а успешное решение — сделать самую простую модель элегантной и броской. Задача же потребителя продукции состоит в том, чтобы найти для себя оптимальное сочетания всех факторов и характеристик в одном изделии. Пусть нам в этом повезет!

С чем носить пудровое пальто: 5 идеальных комбинаций

В этом сезоне многие девушки задаются вопросом: с чем носить пудровое пальто? Ведь уже несколько последних лет из моды не выходит одежда пастельных тонов. Этот сезон не стал исключением. И в качестве верхней одежды модницы предпочитают выбирать пальто пудрового оттенка. Этот цвет представляет нечто среднее между бежевым и бледно-розовым, в общем представляет собой оттенок пудры для лица. Выбрать для себя наиболее удачные сочетания и разобраться с чем носить пальто цвета пудры помогут фото и данная статья.

Содержание статьи

Актуальные модели пальто
В первую очередь при выборе модели пальто нужно учитывать для какого сезона будет использоваться данная вещь. Для зимы стоит брать варианты с утеплителем, а также с меховым воротником. Мех не только согреет в мороз, он также является модной декоративной деталью. В том случае, если на модели ворот из меха отсутствует, то его можно просто заменить меховым шарфом. Также возможны варианты с меховой отделкой или меховыми карманами. Пальто с мехом сейчас очень популярны.
К пудровому цвету пальто подойдёт мех следующих оттенков:
Наиболее модной моделью пальто в данный момент является вариант на поясе, без пуговиц и молний. Такое пальто с запахом немного напоминает халат, но при этом находится на пике популярности. Также актуальны модели oversize которые делают образ немного небрежным, но при этом очень стильным.

С чем носить пальто пудрового цвета: 5 интересных комбинаций
С чем носить пальто цвета пудры? Этот вариант верхней одежды отлично смотрится не только с романтическими платьями и каблуками, но и с более повседневным стилем: с джинсами, грубыми сапогами или ботинками и даже с кроссовками. Причём последнее сочетание сейчас в тренде. Рассмотрим комбинации подробней.
Повседневный вариант. Универсальность пудрового пальто в том, что оно прекрасно смотрится с большинством вещей из гардероба любой девушки. Поэтому его можно сочетать с любой самой невзрачной одеждой. В этом случае пальто само по себе станет ярким акцентом образа. Особенно эффектно выглядит сочетание с кожаной юбкой-карандаш. Не менее стильным получится лук в комбинации с юбкой плиссе.
Вариант деним: сочетание пальто с черными джинсами. Это как раз оптимальный вариант для кроссовок. Так как джинсы — тоже универсальный предмет одежды, комбинировать такой образ можно с чем угодно. В качестве верха, кроме свитеров и кардиганов, отлично смотрятся рубашки.
Сочетание с платьем. Это могут быть самые разнообразные платья: различных фасонов и цветов. Такая комбинация смотрится очень гармонично.
Резиновые сапоги. Этот предмет гардероба не только весьма практичный, но и очень модный. Сейчас модели резиновой обуви делают стильными и почти не отличимыми от обычных сапог. Для сочетания с пальто пудрового оттенка подойдут сапоги, как нейтральных оттенков, так и ярких (например — фуксия).
Голубые аксессуары. Нежно-розовый оттенок прекрасно сочетается с пастельно-голубым. Поэтому удачным выбором для модниц будет выбор сумки или шарфа и шапки голубого цвета.
Пальто цвета пудры представляет собой универсальный предмет одежды, комбинаций и сочетаний с которым можно составить массу.
Пальто пудрового цвета — с чем сочетается, наиболее удачные варианты
Теперь перейдём к вопросу: с чем сочетать пальто пудрового цвета. В зависимости от выбора остальной одежды к пальто пудрового оттенка, можно сделать свой образ динамичным и ярким, или же нежным и девичьим. Вот шесть наиболее удачных вариантов для сочетания:
Синий цвет. К образу подойдут джинсы любого оттенка.
Пастельные тона. Кроме голубого цвета, нежно-розовый оттенок пальто будет хорошо смотреться с другими нюдовыми оттенками.
Белый цвет. Крайне непрактичный вариант для одежды в межсезонье, но в качестве цвета аксессуаров смотрится великолепно.
Красный или оранжевый. Такое сочетание смотрится очень динамично и интересно. Для этого стоит подобрать юбку или брюки насыщенного оттенка.
Серый цвет. Такое сочетание стоит выбирать для повседневного и делового стиля. Благодаря пудровому оттенку такое сочетание не будет смотреться скучно.
Чёрный цвет. Этот цвет способен добавить образу строгости.
Какого цвета шарф подойдёт к пудровому пальто
Шарф — наиболее популярный согревающий аксессуар, который необходимо правильно подобрать к верхней одежде. Какой же шарф подойдёт к пудровому пальто?
В зависимости от сезона и погоды можно использовать шарфы из разных материалов: это могут быть модели из шёлка, вискозы, хлопка или вязанные шарфы. К пальто цвета пудры подойдёт любой из этих вариантов. Цвет и оттенок данного аксессуара стоит выбирать, используя советы из предыдущего раздела. Чтобы посмотреть со стороны, как смотрится женское пальто пудрового цвета с различными вариантами шарфов, стоит посмотреть фото-примеры с чем его носить.
Также не стоит забывать, что при выборе шарфа стоит ориентироваться на своё лицо. Поэтому перед покупкой стоит обернуть шарф вокруг лица и оценить как оно смотрится.
Пальто в пудровом оттенке выглядит элегантно и стильно, а главное его преимущество в том, что оно сочетается практически со всеми цветами. Трудности, что подобрать к данному оттенку, возникнуть не должно. Если после прочтения данной статьи всё ещё возникают вопросы с чем носить пальто пудрового цвета, то фото из модных журналов или интернета помогут сложить в голове желанный образ.
Какие цвета галстуков подходят к цветам рубашек: 12 рекомендаций
10 правил хорошего тона: как одеваться женщине в 55 лет стильно
C чем одеть юбку карандаш: 5 модных советов
Как одеваются француженки в повседневной жизни: 6 беспроигрышных вариантов
Итальянские бренды одежды для женщин — от массовых до лакшери

Укажите свой e-mail и получайте новые статьи на почтовый ящик
Коричневое пальто — лучший выбор для повседневного образа
Уже давно доказано влияние цвета на психологическое состояние человека. Поэтому одежда, которую мы носим, вызывает у окружающих различные ощущения и, порой, двоякие чувства. Коричневое пальто для многих женщин стало настоящим объектом поклонения, но некоторые считают его слишком скучным. Однако, несмотря на такое спорное отношение к коричневому, большинство людей предпочитают формировать базовый гардероб на основе этого природного цвета. Его легко комбинировать с другими и создавать с помощью полученных гармоничных сочетаний подходящий образ.
Особенности коричневого цвета
Теплота и мягкость коричневого цвета в одежде способствует дружескому общению, откровенным разговорам. Разнообразие коричневых оттенков позволяет выбрать именно тот, который подойдет к любой ситуации. В нем можно смело отправляться на важное собеседование или встречу. Ведь человек в коричневом костюме или пальто всегда выглядит солидным и надежным, готовым к длительным деловым отношениям.
Для яркой брюнетки со смуглой загорелой кожей и белокурой блондинки с голубыми глазами коричневый также может стать любимым. Тем более, что его магические свойства неразрывно связаны с землей. Именно с его помощью можно подчеркнуть незыблемость своих убеждений и уверенность в завтрашнем дне.
Модели
Дизайнеры одежды разрабатывают современные модели мужских и женских коричневых пальто, подбирают для них ткани. Самыми подходящими для верхней одежды считаются — шерсть, драп, кашемир, кожа, букле, твид. У каждого материала свои свойства, которые соответствуют разным погодным условиям и сезонам. К популярным в настоящее время относятся такие модели пальто:
классические, которые можно отнести к стандартному виду, и усовершенствованные;
с застежкой-молнией и особенно с запахом;
свободного фасона;
прямого кроя;
различные виды пончо;
зимние и демисезонные модели;
оверсайз, летучая мышь.
Длину пальто женщины выбирают самостоятельно. Поскольку нет определенных требований и своеобразных догм, утверждающих, какая именно длина верхней одежды востребована.
Оттенки
В коричневой гамме очень много различных оттенков. Самые светлые из них близки к бежевому, а вот крем-брюле уже можно считать полноценным коричневым, только довольно мягким и теплым. В одну группу с ним можно объединить песочный, известный всем по очень модным пальто camel, золотистый мокко, ореховый, каштановый. А вот землистый оттенок или жженая умбра подойдут для тех пальто, которым необходимы более темные ткани.
Женское коричневое пальто
Выбор верхней одежды зависит от цветотипа человека, который и определяет, теплым или холодным оттенкам отдать предпочтение. Возрастных ограничений никаких нет, коричневые пальто с радостью наденут пятилетние дети, молодые девушки и пожилые люди. Все дело в том, что даже в классических моделях нет такой категоричной, безапелляционной строгости. Большинство моделей ярких трехцветных пальто с преобладанием коричневого также подходят всем. Теплые оттенки медно-коричневого, ванильного или терракотового согреют ранним весенним утром и хмурым осенним днем.
Стиль
Популярность коричневых пальто связана с возможностью широкого выбора модных направлений. Верхняя одежда в такой гамме может быть следующих стилей:
классического — с его элегантностью, качеством и умеренностью;
романтического — мягко подчеркивающего достоинства фигуры, сочетающего различные объемы и отделку в виде рюшей, воланов или вышивки;
спортивного — со свободным кроем и укороченной длиной;
casual — повседневный тип верхней одежды, с четкими и лаконичными линиями кроя;
милитари — с прямыми или трапециевидными силуэтами, воротниками-стойками, накладными карманами, металлическими пуговицами и подчеркнутой линией плеч.
Модный образ нужно создавать с учетом особенностей фигуры, иначе пальто с неподходящим силуэтом может лишь усугубить ее недостатки.
Фасон
Лидирующие позиции в модных показах всегда занимают пальто с эффектными и оригинальными видами кроя. Прямые или в виде трапеции подходят людям с самыми разными фигурами, полным и худым. Дизайнеры разрабатывают все новые линии силуэта и вырезы горловины, экспериментируют с расположением и формой карманов. Объемные трехцветные полупальто, слегка мешковатые, но очень оригинальные, смотрятся довольно интересно.
Странные, на первый взгляд, модели с рукавами в три четверти не мешают движениям, нужно лишь подобрать более длинные перчатки или надеть свитер толстой вязки.
Коричневые пальто с капюшонами покоряют людей всего мира своей практичностью и универсальностью. В них не страшен пронизывающий ветер или внезапный снегопад, даже от моросящего дождика можно спрятаться на какое-то время.
Обувь
Цвет обуви, которую предполагают надеть под коричневое пальто, обычно имеет другие оттенки. Под классические модели подойдут черные сапоги и элегантные туфли. А вот пончо или модные классические кейпы-пальто дополнят ботильоны, ботфорты, лодочки на шпильках.
Аксессуары
Современные дизайнеры уже не настаивают на том, что цвета аксессуаров и обуви должны совпадать. Они советуют обратить внимание на красные оттенки при выборе сумок, так как их сочетание с коричневым смотрится очень гармонично. Дорогие кожаные перчатки составят целостный ансамбль с самыми дорогими моделями пальто. От них не стоит отказываться, если только не создается какой-либо эпатажный лук или спортивный. Цвет шапки может быть черным или поддерживающим цвет одного из предметов одежды. Также подойдут белые, красные шляпки, береты, вязаные модели.
С чем носить и какой лук создавать
Если под коричневым пальто просматривается одежда другого цвета, но такая же однотонная, то такой аутфит можно разбавить более ярким клетчатым шарфом. Светлый объемный шарф дополнит пальто оверсайз, а мягкая вязаная шапка гармонично вольется в любой, даже классический лук.
В молодежной моде свои приоритеты. Поэтому в мегаполисах и больших городах можно довольно часто встретить девушек в модных пальто с кроссовками или даже кедами. Фасоны пальто в этом случае обычно прямые, удлиненные или короткие, с небольшими воротниками, капюшонами.
Светло-коричневое
Очень модное пальто цвета какао, имеющее нежный розовый оттенок, носят с белым или розовым палантином или шапочкой, а вот аксессуары в этом случае лучше подбирать красного цвета.
Под светлое бежевое пальто подойдет черное или серое платье с большим вырезом и аксессуары, а в качестве освежающего элемента можно надеть белую блузку с отложным воротником. Светло-коричневое пальто песочного оттенка и леопардовый принт на платье великолепно дополняют друг друга. К такому комплекту подойду черные туфли, ботильоны или ботинки.
Темно-коричневое
Такое пальто будет выигрышно смотреться вместе с синими или темно-красными элементами одежды. Темно-коричневый — популярный оттенок, с ним легко создавать контрастные или спокойные сочетания. Его комбинация со светло-коралловой блузкой или платьем подчеркивает насыщенность и контрастность. А вместе с оранжевым или облепиховым цветом получится гармоничное сочетание, вызывающее воспоминания о теплой осени.
Темно-коричневый и холодный зеленый, например, полынь или малахитовый, создают интересную пару. Одежда из таких элементов подойдет светловолосым женщинам.
Замшевое
Оригинальное замшевое пальто больше всего подходит для начала осени, солнечных и сухих дней. Требующую специального ухода замшу не стоит носить в дождливые дни, так как грязь, попавшую на нее, будет довольно сложно очистить. Из-за особенностей материала фасоны замшевых пальто довольно простые и приближены к классическим. С ними хорошо смотрятся закрытые темно-коричневые туфли на невысоком каблуке и бежевые сумки.
С меховой отделкой
Зимнее коричневое пальто с мехом весьма популярно в холодный период. Эта отделка улучшает внешний вид этих модных изделий, делает их более элегантными. С ними непременно нужно носить стильную обувь и дорогие аксессуары.
Короткое
Коричневые укороченные пальто, больше похожие на куртки, уже несколько сезонов не теряют свое популярности. Универсальность изделий позволяет носить их с брюками, узкими юбками и джинсами.
Без воротника
Такое пальто дает возможность выбора самых разных шарфов в холодную погоду, а в теплую допускает его использование без дополнительных элементов. Это позволяет создавать самые разные образы и подбирать стильную одежду. Иногда эту модель носят с теплым вязаным свитером с высоким воротом.
С чем носить мужское коричневое пальто
В настоящее время никто не полагает, что мужское пальто коричневого цвета, как на фото, следует носить с деловыми костюмами или другой одеждой в классическом стиле. Новые направления в моде, более демократичные и допускающие смешение стилей, не ограничивают фантазию и возможность комбинирования различных элементов одежды. Поэтому так популярны пальто в стиле милитари, спортивном или casual.
Как построить образ в зависимости от модели пальто
Фасонов и моделей мужских пальто много. Они могут быть прямыми и приталенными, короткими или более длинными, с различными воротниками и карманами или вообще похожими на военный бушлат. К темно-коричневому пальто идеально подходит коричневый жилет и такого же цвета оксфорды из замши.
Еще одним видом консервативного лука можно назвать комплект коричневого пальто, серого костюма с бежевой водолазкой и желтоватых кед. Для рабочих будней пригодится сдержанный лук из темно-коричневого укороченного пальто и синих зауженных джинсов.
С какой одеждой по цвету сочетать
Независимо от оттенка коричневого, одежда черного цвета, надетая под пальто, создаст довольно интересное, контрастное сочетание. Особенно выразительно в этом случае станут смотреться бежевые, горчичные, кирпичные или шоколадные оттенки.
Прекрасный комплект одежды, подходящий для самых разных случаев, — коричневое пальто, брюки другого оттенка или черные и, конечно же, белые рубашки и свитера. Для создания делового образа и фешенебельного внешнего вида мужчины дополняют коричневое пальто одеждой белого и черного, серого цветов и другими пастельными оттенками.
Обувь и аксессуары
Формирование мужского лука на базе коричневого позволяет полностью ориентироваться на индивидуальные предпочтения. Аксессуары легко выбрать из самых популярных на данный момент шляп, зонтов, кожаных перчаток, стильных солнцезащитных очков, шарфов. Их можно брать в любой «комплектации», а вот цвета подбирать нужно очень тщательно. Для мужского образа важна сдержанность, поэтому количество задействованных оттенков следует ограничить. Обувь должна соответствовать общему стилю. Если это классика, то черные туфли и ботинки значительно усилят общее впечатление.
Полезные советы
Большинство моделей коричневых пальто смотрятся очень фешенебельно, поэтому их принято совмещать с оттенками синего, зеленого и красного цвета. Но и лук, созданный на тональной растяжке сочетаний коричневых оттенков, может быть довольно интересным как для мужчин, так и для женщин.
Длинное пальто коричневого цвета подходит только для мужчин высокого роста, а вот женщины могут дополнить образ обувью на высоком каблуке и этим устранить возможную проблему. Тем, кто часто ездит за рулем, лучше выбирать короткое коричневое пальто.
Шерстяные пальто, в отличие от синтетических, при надлежащем уходе долго служат и сохраняют первоначальный вид. Такие модели мужских пальто как честерфилд, несмотря на всю роскошь и качество материала, органично вписываются в деловой стиль.
Коричневое пальто – универсальный элемент и мужского, и женского гардероба. Эту базовую вещь можно сочетать с джинсами и классическими брюками, кедами и элегантными туфлями. Благодаря особенности цвета пальто получится удачно вписать как в деловой дресс-код, так и в повседневный городской лук.
<noscript><img src='/800/600/https/cs2.livemaster.ru/storage/3d/46/49687ab6c3ef1c1b456dd3d95cij--odezhda-palto-halat-izumrud-look-2.jpg' /></noscript> youtube.com/embed/QPUqTMHn2V4″ frameborder=»0″ allow=»accelerometer; autoplay; encrypted-media; gyroscope; picture-in-picture» allowfullscreen=»»/>
границ | Новый бледно-желтый окрас шерсти кроликов, полученный посредством мутации MC1R с помощью системы CRISPR / Cas9
Введение
Цвет шерсти животного — одна из наиболее важных характеристик породы, которая является не только важным продуктивным признаком, но и незаменимым экономическим признаком. В качестве важного генетического маркера для молекулярной селекции долгое время большое внимание уделялось наследованию цвета шерсти кроликов. У млекопитающих локус Extension кодирует рецептор меланокортина 1 (MC1R), который в основном экспрессируется в волосяном фолликуле и меланоците кожи, тесно связанных с пигментацией кожи.Активация альфа-меланоцит-стимулирующего гормона (MSH) инициируется комплексной передачей сигналов MC1R, что приводит к производству черного и темно-коричневого пигментов эумеланина. Сигнальный белок агути (ASIP) противодействовал рецепторам разными путями, вызывая переключение с пигмента эумеланинового типа на феомеланин (Lu et al., 1994; Ollmann et al., 1998) и продуцируя желтые или красные пигменты. MC1R — высокополиморфный ген. Мутации в некоторых локусах однонуклеотидного полиморфизма (SNP) были показаны в изменении цвета шерсти млекопитающих, таких как красная морская свинка (Cone et al., 1996), каштановая лошадь (Marklund et al., 1996) и корова голштинской породы с красной кожей (Joerg et al., 1996). Кроме того, мутаций гена MC1R , связанных с разными цветами шерсти, были описаны у людей (Valverde et al., 1995), мышей (Robbins et al., 1993), свиней (Kijas et al., 1998; Kijas et al., 2001), крупный рогатый скот (Klungland et al., 1995; Rouzaud et al., 2000), овцы (Vage et al., 1999), козы (Fontanesi et al., 2009), собаки (Everts et al., 2000; Newton et al., 2000), куры (Kerje et al., 2003) и лисы (Vage et al., 1997; Vage et al., 2005), при котором количество функциональных мутаций увеличивалось, приводя к черному / темному окрасу шерсти, а отсутствие функций обычно приводило к первоначальному / желтому окрасу шерсти.
На домашних кроликах ( Oryctolagus cuniculus ) традиционные генетические исследования проводились в экспериментах по скрещиванию пород с разным окрасом шерсти, в которых в локусе Extension были распознаны пять аллелей, представляющих следующее: E ^D показывает черный доминант ; E ^S представляет собой сталь, являющуюся более слабой версией E ^D; E дикого типа (WT) выражает нормальный серый цвет или расширение черного цвета; e ^J существует в японском цвете тигрового окраса с мозаичным распределением желтого и черного цветов; и е выражает красно-желтый вид с белым животом.Порядок E ^D> E ^S> E> e ^J> e показал доминирование (Robinson, 1958; Fox, 1994). Fontanesi et al. (2006) идентифицировали делецию в рамке считывания, связанную с двумя возможными вариантами: рецессивный красный (c.304_333del30; аллель e) и черный доминантный (c.280_285del6; аллели E ^D и / или E ^S) окраса шерсти посредством секвенирования почти полной кодирующей последовательности (CDS) кроличьего гена MC1R . Осведомленность о роли и механизме гена MC1R в определении окраски шерсти в основном зависела от анализа спонтанных мутаций у сельскохозяйственных животных.Специфичные для генома манипуляции важны для дальнейшего изучения функции гена MC1R и обеспечения понимания механизма окраски шерсти с изменением и формированием путем точной модификации в гене MC1R .
Хотя широко известно, что полиморфизм гена MC1R связан с окрасом шерсти животных, большинство исследований сосредоточено только на корреляции между спонтанными мутациями и фенотипом у различных видов животных. По-прежнему отсутствуют эффективные модели животных MC1R -нокаут (KO) для дальнейшего изучения функции MC1R .Здесь, используя систему редактирования генома CRISPR / Cas9, мы можем частично или полностью разрушить структуру белка MC1R , что может помочь нам лучше понять механизм этого гена. Более того, это первое исследование с использованием этой системы для создания модели млекопитающего и изучения функции MC1R, а использование системы CRISPR / Cas9 позволяет искусственно получать животных с популярными или новыми цветами шерсти.
В попытке выяснить, соответствует ли фенотип, продуцируемый искусственно модифицированным геном MC1R , фенотипу спонтанной мутации с потерей функции, мы нокаутировали ген MC1R черного кролика Ляньшань (BR). с помощью двойной sgRNA-управляемой системы CRISPR / Cas9 и получили двух мутировавших кроликов MC1R с бледно-желтой шерстью, которые заметно отличались от диких желтых кроликов.В нашей настоящей работе мы впервые обнаружили новый цвет шерсти у кроликов путем прерывания гена MC1R через CRISPR / Cas9. Кролик MC1R -KO может быть использован в качестве модели для дальнейшего изучения информации гена MC1R о различных цветах шерсти.
Материалы и методы
Отбор проб кроликов
Зажимы для ушей пяти отдельных кроликов [один BR, один YR, один новозеландский белый кролик (WR), один серый гигантский кролик (GR) и один клетчатый гигантский кролик (CR)] были взяты образцы, и геномная ДНК была извлечена из тканевого лизата с использованием фенол-хлороформа и выделена осаждением спиртом.
Клонирование и анализ кролика
MC1R
Для клонирования и анализа гена кролика MC1R в качестве матрицы для ПЦР-амплификации использовали геномную ДНК из BR, YR, WR, GR и CR в равных количествах (100 нг). парой специфических праймеров ( MC1R -F: 5′-GGTGGCTGGTGTGGAAATGT-3 ‘и MC1R -R: 5′-GCTGGCAAAGGGGCACTA-3′), которые были сконструированы на основе последовательности кролика MC1R : FN658676.1). Набор для экстракции геля (Omega Bio-Tec, США) использовали для очистки продукта ПЦР и для клонирования в вектор pMD18-T (Takara, Япония).Десять положительных клонов каждого кролика (всего 50 клонов) были секвенированы и затем проанализированы с использованием BioEdit и MEGA7. Кроме того, CDS гена MC1R двух других пород, кролика трианта (GenBank: FN658678.1) и японского тигрового окраса (GenBank: FN658679.1), были добавлены при множественном выравнивании последовательностей.
Дизайн sgRNA и конструирование плазмиды
В наших предыдущих опубликованных данных протоколы конструирования sgRNA и конструирования векторов были подробно обсуждены (Su et al. , 2018). Двойной sgRNA, нацеленный на ген кролика MC1R , был разработан в соответствии с результатом выравнивания множественных последовательностей кроликов разного цвета, и эти два целевых сайта избегали областей спонтанной делеции в гене кролика MC1R .
In vitro Транскрипция мРНК Cas9 и sgRNA

Плазмида экспрессии hSpCas9 (CMV-T7-NLS-hSpCas9-NLS) была линеаризована эндонуклеазой рестрикции Eco RI, готовящейся для транскрипции мессенджера hSpCas9 (мессенджер 9000RNA). .sgRNA с промоторной последовательностью T7 (TAATACGACTCACTATAGG) в восходящем направлении были сделаны для продукции sgRNA путем транскрипции in vitro . Матрицы, использованные для создания sgRNA, были получены с использованием праймеров, перечисленных в таблице S1. Линеаризованную плазмиду hSpCas9 и амплифицированный продукт T7-sgRNA подвергали гелевой очистке и применяли в качестве матрицы для транскрипции in vitro , соответственно, с помощью набора mMESSAGEmMACHINE ^® T7 (Ambion, США) и набора MEGAshortscript ™ T7 Kit. (Ambion, США) в строгом соответствии с протоколом, рекомендованным производителем.Качество и концентрацию РНК оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле и определяли на спектрофотометре BioSpec-nano UV-Vis (Япония) соответственно. Как мРНК Cas9, так и sgRNA очищали с помощью набора для очистки транскрипции MEGAclear ^TM (Ambion, США), элюировали водой, не содержащей РНКаз, и замораживали при -80 ° C.

Сбор, микроинъекция и трансплантация эмбрионов

Суперовуляция была проведена у самок BR в возрасте 6-8 месяцев с использованием 1,2 мг фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) с интервалом в 12 часов шесть раз после спаривания с самцом BR и затем вводили 100-МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).Через 18 часов после инъекции ХГЧ кроличьи эмбрионы собирали на стадии пронуклеуса, промывая яйцеводы 5-мл средой для обработки ооцитов. Смесь in vitro транскрибированной мРНК Cas9 (100 нг / мкл) и sgRNA (20 нг / мкл на sgRNA) микроинъектировали в цитоплазму оплодотворенных яиц. Инъецированные зиготы переносили в среду для культивирования эмбрионов и культивировали при 38,5 ° C в 5% CO ₂ в течение 5–10 мин. Затем около 14–16 инъецированных эмбрионов были аутологически трансплантированы в яйцевод кролика-донора.

Определение эффективности мутаций в бластоцистах и детенышах с помощью ПЦР и секвенирования

Для проверки индел-мутаций инъецированные эмбрионы собирали на стадии бластоцисты. Геномную ДНК экстрагировали из одиночной бластоцисты с помощью буфера для лизиса клеток (Ambion) при 75 ° C в течение 15 минут и 95 ° C в течение 10 минут. Сайты-мишени sgRNA были амплифицированы с использованием высокоточной ДНК-полимеразы Golden Star T6 (TsingKe, Пекин, Китай). Праймеры ПЦР, используемые для обнаружения мутаций, были следующими: F, 5′-ACAGCCTCCCCCAGTCCT-3 ‘; R, 5’-GCACCTCCTTGAGCGTCC-3 ‘.Геномную ДНК новорожденных кроликов MC1R KO и WT экстрагировали из небольшого образца ткани уха с использованием трис-фенола / хлороформа. Праймеры MC1R -F / R использовали для генотипирования ПЦР. После очистки в геле продукты ПЦР клонировали в простой вектор pEASY-blunt (TransGen, Пекин, Китай), а затем подвергали секвенированию по Сэнгеру. Мутации были идентифицированы посредством выравнивания секвенированных аллелей с WT.

Прогнозирование модифицированной структуры белка MC1R у кроликов

MC1R KO

Для оценки влияния целевой делеции были выбраны пять основных целевых модификаций.Их 3D-модели были созданы с помощью онлайн-программы Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index). Два спонтанных аллеля белка MC1R были выбраны в качестве контроля.

Анализ вне мишени

Проверяя, представлены ли нецелевые мутации у кроликов MC1R -KO, мы спрогнозировали потенциальные нецелевые сайты (POTS) sgRNAs с помощью онлайн-инструмента CRISPR Design Tool, разработанного группой Zhang at Массачусетский технологический институт (http: // crispr.mit.edu/), и мы выбрали восемь лучших POTS для каждой sgRNA. Затем продукты ПЦР этих POTS подвергали анализу T7E1 и анализу последовательности Сэнгера. Все праймеры для нецелевого анализа перечислены в таблице S2.

Анализ расщепления T7E1

Продукты ПЦР POTS очищали в геле. Затем раствор, содержащий 5 мкл продуктов ПЦР, 1,1 мкл NEBuffer 2.1 и 4,4 мкл сверхчистой воды, инкубировали при 95 ° C в течение 10 минут, а затем отжигали при комнатной температуре в течение не менее 30 минут. После этого гибридизированные продукты ПЦР обрабатывали 5-МЕ T7E1 (NEB) в течение 30 минут при 37 ° C и, наконец, подвергали 2.Электрофорез в 5% агарозном геле.

Гистологический анализ

Кожные ткани кроликов BR и MC1R -KO фиксировали 4% параформальдегидом в течение 24 часов при 4 ° C. Возрастающие концентрации дегидратированного этанола (70% в течение 7 часов, 85% в течение 5 часов, 90% в течение 2 часов, 95% в течение 2 часов и 100% в течение 2 часов), деалкоголизированного ксилолом и залитого в парафин, были использованы для гистологическое исследование. Залитые парафином ткани, которые были разрезаны на срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и анализировали с помощью флуоресцентного инвертированного микроскопа (Nikon, Япония).Анализ интегральной оптической плотности (ИОП) гистологических срезов проводили с помощью программы Image-Pro Plus 6.0.

Количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)

Суммарную РНК экстрагировали из шкур кроликов BR, YR и MC1R -KO с помощью реагента TRIzol (Ambion, Life Technologies, США) в соответствии с протоколом производителя. затем обрабатывали ДНКазой I (Thermo Scientific, США) и подвергали обратной транскрипции в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием набора RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific).qPCR выполняли с использованием смеси ChamQ ™ Universal SYBR® qPCR Master Mix (Vazyme Biotech, Nanjing, China) с системой реального времени ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, США), и относительную экспрессию генов нормализовали до глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). ) определяли по формуле 2 ^{— ΔΔCT}. Все данные по экспрессии генов были выполнены трижды. Гены-кандидаты представляли собой фактор транскрипции, связанный с микрофтальмией ( MITF ), тирозиназу ( TYR ), родственный тирозиназе белок 1 ( TYRP1 ) и допахромтаутомеразу ( DCT ).Конкретные праймеры для КПЦР перечислены в таблице S3.

Статистика

Все количественные данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего, по крайней мере, с тремя отдельными определениями во всех экспериментах. Данные были проанализированы с помощью t -теста с использованием программы SPSS 17.0. Вероятность p <0,05 считалась статистически значимой.

Результаты

Связь

генотипов MC1R и фенотипов окраски шерсти

Клонированы отдельно 1409 п.н. (рассматриваемых как последовательность WT) гена MC1R (вся CDS 954 п.н. была амплифицирована и секвенирована, 362 п.н. 5′-нетранслируемой области и 93 п. н. 3′-нетранслируемой области) у пяти кроликов с разным окрасом шерсти, а именно BR, YR, WR, GR и CR.Последовательности, полученные из WR, CR и BR, идентифицировали присутствие делеции в 6 п.н. в рамке считывания (c.281_286del6, аллель E ^D). C.304_333del30 был идентифицирован у кроликов YR и Thrianta как детерминант аллеля е. Другая делеция из 6 пар оснований, фланкированная переходом G> A в 5 ‘(c. [124G> A; 125_130del6]), существовала в японском аллеле тигрового окраса e ^j (рис. 1A). Ген MC1R GR был WT аллелем E, который кодировал 317 аминокислот (AA). Аллель E ^D, несущий WR, CR и BR, имел делецию из двух аминокислот во втором трансмембранном (TM) домене.Аллель е, принадлежащий YR и кролику Thrianta, имел делецию из 10 аминокислот в первой внеклеточной петле. А аллель японского тигрового окраса (e ^j) имеет два AA в первом домене TM (рис. 1B). Эти три мутации были спонтанными.

Рисунок 1 Множественное выравнивание последовательностей гена и белковых структур кролика MC1R . (A) Выравнивание множественных экзонных последовательностей гена MC1R серого гигантского кролика (GR), новозеландского белого кролика (WR), клетчатого гигантского кролика (CR), черного кролика Ляньшань (BR), желтого кролика Фуцзянь ( YR), кролик трианта (GenBank: FN658678.1) и японского тигрового окраса (GenBank: FN658679.1). Шесть нуклеотидов в синем и зеленом прямоугольниках — это те, которые удалены в аллелях c.125-130del6 и c.281-286del6 гена кролика MC1R , соответственно. 30 нуклеотидов в красном поле — это те, которые удалены в аллелях c.304-333del30. (B) Спонтанные мутации, переносимые кроликами разных пород и окрасов шерсти. MC1R Ген GR представляет собой аллели дикого типа, которые кодируют 317 аминокислот. Две аминокислоты в синем кружке — это те, которые удалены в c.Аллель 125-130del6 (e ^J), переносится японским тигровым кроликом. Две аминокислоты в зеленом кружке — это аминокислоты с делециями в аллелях c. 125-130del6 (E ^D), которые переносятся WR, CR и BR. И 10 аминокислот в красном кружке — это те, которые удалены в аллелях c.304-333del30 (e), принадлежащих YR и кролику Thrianta (диаграмма аминокислотного состава зрелого белка MC1R кролика с семью трансмембранными доменами была изменена из Вольф Хоррелл и др. (2016).

Дизайн и определение эффективности sgRNA, нацеленного на кролика

MC1R Gene

С целью уничтожения MC1R в BR была разработана двойная sgRNA, нацеленная на CDS MC1R , согласно к результату множественного выравнивания последовательностей кроликов разного цвета, что позволило избежать участков естественной делеции в гене кролика MC1R (рис. 2А).Поскольку наличие спонтанных мутаций, мы не проводили анализ T7E1 в этом определении, а результаты редактирования были подтверждены анализом последовательности Сэнгера. Как показано на фиг. 2B, C, мутации были идентифицированы в шести из этих семи бластоцист (85,7%). В каждой мутировавшей бластоцисте были разные делеции длинных фрагментов. Эти результаты показали, что система CRISPR / Cas9 с двойной sgRNA эффективно нокаутировала кролика MC1R в нашем исследовании.

Рисунок 2 Делеция MC1R , направленная на двойную однонаправляющую РНК (sgRNA), в зиготах. (A) Схематическая диаграмма sgRNA, нацеленная на локусы гена MC1R кролика. Желтый прямоугольник представляет трансмембранный домен MC1R. Две последовательности sgRNA, sgRNA1 (Sg1 #) и sgRNA2 (Sg2 #), выделены зеленым. Последовательности смежных мотивов протоспейсера (PAM) представлены красным цветом с подчеркиванием. Праймеры F и R используются для обнаружения мутаций в эмбрионах. (B) Цитоплазматическая инъекция зигот с использованием системы CRISPR / Cas9. Собрано семь бластоцист. Обнаружение мутации в бластоцисте методом ПЦР.М, маркер; числа 1–7 представляют разные бластоцисты, использованные в этом исследовании. Число в красном цвете соответствует положительным эмбрионам. Шкала 100 мкм. (C) Т-клонирование и секвенирование по Сэнгеру модифицированных аллелей MC1R в бластоцистах. Последовательность дикого типа показана вверху целевой последовательности. Последовательности sgRNA отмечены зеленым, последовательности PAM — красным, вставки выделены строчными красными буквами, а делеции обозначены тире. E: эмбрионы; WT: аллель E ^D; удаление: «-»; вставка: «+».

Получение

кроликов MC1R -KO с использованием системы CRISPR / Cas9

После трансплантации эмбриона и доношенной беременности две беременные кролики успешно родили девять живых детенышей (Таблица 1). MC1R Модификации не были обнаружены у семи детенышей от материнского кролика № 1, но все два других детеныша от материнского кролика № 3 имели мутировавший ген MC1R . Как и ожидалось, делеции больших фрагментов гена MC1R присутствовали у этих двух детенышей, пронумерованных Y31 и Y32, и Y31 имел одну последовательность WT, а именно аллель e, по сравнению с BR, но Y32 не имел (Фигуры 3B, C). Как показано на рисунке 3A, в естественных условиях у чернокожих родителей мужского и женского пола с гетерозиготным генотипом (E ^D / e) будут детеныши трех окрасов: черного (B15), желтого (Y11) и белого ( W12). Интересно, что кролики MC1R -KO Y31 и Y32 показали новый красивый окрас шерсти, бледно-желтый, который отчетливо отличался от дикого желтого. И мы обнаружили, что два кролика-основателя несли несколько мутантных генотипов, от делеции 10 пар оснований до делеции более 700 пар оснований. Поскольку удаленный фрагмент слишком длинный и включает спонтанные делеции длиной 6 и 30 пар оснований, невозможно было узнать исходный генотип и исходный цвет шерсти Y32.Но одно можно было сказать наверняка: Y31 сначала нес аллель E ^D, что означало, что он изначально был черным, и этот черный цвет шерсти был изменен на бледно-желтый посредством редактирования гена . В совокупности мы успешно сгенерировали кроликов MC1R -KO с новым цветом шерсти с использованием CRISPR / Cas9.

Таблица 1 Сводка по кроликам MC1R -нокаут (KO), полученным с помощью CRISPR / Cas9.

Рис. 3 Поколение кроликов MC1R -нокаута (KO) с новым цветом шерсти с использованием системы CRISPR / Cas9. (A) Фотографии кроликов MC1R -KO в возрасте 6 месяцев, сделанные с помощью системы CRISPR / Cas9; кролик В15, черный; кролик W12, белый; кролик Y11, желтый; и кролики Y31 и Y32, бледно-желтые. Y31 — самка кролика, а Y32 — самец. (B) Мутацию определяли у кроликов-основателей с помощью ПЦР. М, маркер; 1, Y31; 2, Y32; 3, Y11; 4, W12; 5, W13; 6, W14; 7, В15; 8, В16; и 9, B17. Число в красном цвете представляет мутировавших детенышей MC1R . (C) Т-клонирование и секвенирование по Сэнгеру у девяти детенышей с модифицированными аллелями MC1R .Два аллеля E ^D и e родительских черных кроликов Lianshan (BR) показаны в верхней части целевой последовательности. Самопроизвольные удаления обозначены черными черточками, а соответствующие неудаленные основания показаны синим цветом. Последовательности однонаправляющих РНК (sgRNA) отмечены зеленым, сайты смежных мотивов протоспейсера (PAM) выделены красным, вставки выделены строчными красными буквами, а делеции обозначены зелеными штрихами. Удаление: «-».

Характеристика деструктивных модификаций кроликов

MC1R -KO

Посредством анализа секвенирования было обнаружено два типа модификаций MC1R , обнаруженных в Y31, и четыре типа в Y32.Поскольку есть участие спонтанной делеции 6 пар оснований, обозначенной как D ₆ (c.281_286del6), и делеции 30 пар оснований, обозначенной как D ₃₀ (c.304_333del30) в MC1R CDS, для более интуитивного отображения мы генотипировали все модификации двух кроликов-мишеней с помощью делеций D ₆ или D ₃₀ по сравнению с BR (D означает делецию и N неделецию). Предыдущие исследования показали, что спонтанные мутации D ₆ N ₃₀, а именно аллель E ^D, преобладали у черного кролика, а аллель N ₆ D ₃₀, а именно аллель е, был рецессивным красно-желтым. (Fontanesi et al., 2006). Итак, генотип черного был E ^D / -, а желтого — ее. Как показано на фиг. 4A, генотип Y31 был E ^D / e, а генотип Y32 был — / e, оба из которых являются неопределенными, поскольку все две спонтанные мутации были делециями. Таким образом, было очевидно, что цвет шерсти Y31 был изменен с черного на бледно-желтый с помощью системы CRISPR / Cas9 . Дальнейший анализ показал, что, за исключением четвертого модифицированного типа Y32, который был удален слишком долго, чтобы иметь стартовый кодон, все остальные модификации привели к сдвигу рамки считывания и преждевременному стоп-кодону и, как следствие, к усеченному белку MC1R. что может полностью или частично отменить функцию MC1R.Результат предсказания структуры белка показал, что преждевременное прерывание вызвало отсутствие большинства структур TM, которые были важны для функции MC1R (Рисунок 4B). Можно сделать вывод, что события нацеливания привели к нарушению функции MC1R.

Рисунок 4 Диаграмма спонтанных делеций (D ₆ N ₃₀ или N ₆ D ₃₀) и прогнозирование белковой структуры однонаправленных (sgRNA) / Cas9 целевых модификаций двух MC1R -нокаутных (КО) кроликов. (A) «D ₆» обозначается как спонтанная делеция (по сравнению с N ₆ как неделеция) с делецией длиной 6 п.о. ниже стартового кодона ATG. «D ₃₀» обозначается как спонтанная делеция (по сравнению с N ₃₀ как неделеция) с делецией 30 пар оснований ниже D ₆. Целевые модификации CRISPR / Cas9 проиллюстрированы отдельно на диаграмме выше и ниже спонтанной делеции, которая показывает формы модификаций и предсказанные белковые продукты преждевременного стоп-кодона аминокислот.Последовательности sgRNA отмечены зеленым, сайты PAM — красным, а делеции — зелеными штрихами. (B) Построение моделей MC1R E ^D в соответствии с пятью модификациями и двумя типами WT BR. WT D ₆, структура аллеля MC1R E ^D; WT D ₃₀, структура аллеля MC1R e; Y31 m1, тип редактирования −4 и −39 п.н .; Y31 м2, тип редактирования −278 или 302 п.н .; Y32 m1, тип редактирования −10 п. н .; Y32 м2, вид редактирования −28 п.н .; Y32 м3, вид редактирования −7 и −6 п.н.

Обнаружение нецелевых у кроликов

MC1R -KO

Чтобы определить, присутствовали ли мутации, не соответствующие цели у кроликов MC1R -KO, мы спрогнозировали POTS двух sgRNA с помощью онлайн-инструмента CRISPR Design Tool, разработанного и выбрали восемь верхних POTS для каждой sgRNA. Результаты анализа T7E1 и анализа последовательности Сэнгера показали, что ни одна из нецелевых мутаций не была обнаружена в этих POTS у кроликов MC1R -KO (Фигуры 5A, B). Информация о POTS была перечислена в Таблице S2.

Рис. 5 Обнаружение отклонения от цели у кроликов MC1R -нокаут (KO). (A) ПЦР и T7E1 анализы восьми основных потенциальных нецелевых сайтов (POTS) для Sg1 # и Sg2 #, соответственно. В анализах T7E1 фрагментов не обнаружено. (B) Анализ последовательности хроматограмм 16 POTS для Sg1 # и Sg2 # с использованием продуктов ПЦР в основателях. Никакой двойной кривой не было показано ни на одной из диаграмм секвенирования. Горшки подчеркнуты красным.

Оценка фенотипа кроликов

MC1R -KO и анализ сигнального пути

Результаты гистологического окрашивания H&E показали, что количества эумеланина не присутствовали в волосяных фолликулах кроликов MC1R -KO по сравнению с BR (рис. 6A).И гистограмма показала, что IOD гистологических срезов кроликов KO был значительно ниже, чем у BR (Рисунок 6B). Мы также исследовали, приводит ли нарушение MC1R к снижению экспрессии нижележащего гена сигнального пути MC1R (рис. 6D) в ткани кожи. Как показано на рисунке 6C, уровни мРНК гена MITF , TYR , TYRP1 и DCT были значительно снижены у кроликов MC1R -KO по сравнению с контрольной группой BR.Эти результаты также показывают, что потеря функции белка MC1R способствовала блокированию синтеза эумеланина и создавала новый цвет шерсти у кроликов MC1R -KO.

Рисунок 6 Идентификация фенотипа и экспрессия нижестоящих генов в сигнальном пути MC1R кроликов MC1R -KO. (A) Окрашивание кожи H&E кроликов BR и KO. BR — черный кролик Ляньшань; H&E, гематоксилин и эозин; КО, MC1R — кролики-нокауты.Шкала 100 мкм для 400 ×. (B) Анализ интегральной оптической плотности (IOD) гистологических срезов с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus. (C) Относительную экспрессию генов MITF , TYR , TYRP1 и DCT определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Гистограммы показывают средние значения. Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку (SE). (D) Взаимосвязь MITF , TYR , TYRP1 и DCT в пути меланогенеза.Гены с зеленой рамкой значительно подавлены в коже KO по сравнению с кожей BR. BR — черный кролик Ляньшань; YR, желтый кролик провинции Фуцзянь; КО, MC1R -КО кролик. * 0,01 < p <0,05; ** p <0,01 (схема пути меланогенеза была упрощена из базы данных путей KEGG, 04916, 23. 10.15, Kanchisa Laboratories).

Обсуждение

MC1R состоит из семи α-спиральных (TM) доменов с мотивом DRY на стыке третьего домена TM, внутриклеточного C-конца, связанного с сайтом пальмитоилирования, и внеклеточного N-конца, присоединенного к N -связанный сайт гликозилирования, как и другие рецепторы, связанные с G-белком (GPCR) (Yang, 2011).Внеклеточный N-концевой хвост выполняет следующие функции: (1) сродство к лиганду (Chhajlani et al., 1996) и (2) знаковый якорь (Wallin and von Heijne, 1995; Garcia-Borron et al., 2005). Существует консервативный остаток цистеина, присутствующий на N-конце соединения и в первом TM-домене, который полностью необходим для функции рецептора (Frandberg et al., 2001). С-конец в GPCR часто играет роль в переносе белков из эндоплазматического ретикулума на плазматическую мембрану (Schulein et al., 1998; Qanbar and Bouvier, 2003), а также во взаимодействии рецепторов с белком G на плазматической мембране (Strader et al., 1994). Предыдущие исследования продемонстрировали, что мутации, которые прерывают пентапептид или, особенно, вариант трипептида, такие как преждевременная терминация по R306 (Newton et al. , 2000) или удаление концевого пентапептида (Sanchez-Mas et al., 2005), приводят к минимальному количеству плазмы. мембранная экспрессия MC1R. поскольку внеклеточные петли MC1R соединяются с лигандами, мутации в этой области влияют на сродство связывания (Chhajlani et al., 1996). Сходным образом внутриклеточные петли mc1r играют жизненно важную роль в связывании белка Gs. Таким образом, любая потеря функции из-за мутаций гена MC1R может повлиять на сигнальный путь MC1R и вмешаться в меланогенез.

Аллель WT E гена кролика MC1R имеет 317 AA, а фенотип окраса шерсти нормальный серый, как у GR. Аллели E ^D и E ^S удаляют два AA во втором домене TM (c.280_285del6) и приводят к преобладанию черного и стального цветов покрытия соответственно (Fontanesi et al., 2006). Следовательно, черные породы, такие как BR, безусловно, несут этот доминантный аллель (E ^D / E ^D или E ^D /−). Рецессивный аллель удаляет 10 AA первой внеклеточной петли (c. 304_333del30) и находился в гомозиготное состояние у всех красных / желтых кроликов, таких как породы Тюрингия и YR (Fontanesi et al., 2006). В нашем исследовании результат секвенирования CDS полного гена MC1R GR, WR, CR, BR и YR соответствовал предыдущим отчетам. Разумно предположить, что ген MC1R -KO BR будет давать желтый фенотип.

В попытке выяснить, соответствует ли фенотип, продуцируемый искусственно модифицированным геном MC1R , фенотипу спонтанной мутации потери функции, ген MC1R стал мишенью для системы CRISPR / Cas9. Путем совместной инъекции sgRNA и мРНК Cas9 в зиготы кроликов мы получили двух кроликов MC1R -KO нового цвета шерсти. Секвенирование по Сэнгеру показало, что делеция в гене MC1R кроликов-основателей варьировала от 10 до более чем 700 п.н.Модель MC1R -KO у млекопитающих была представлена впервые. По сравнению с диким желтым кроликом цвет шерсти кроликов MC1R -KO был явно светлее (рис. 3А). Стоит отметить, что в потомстве кроме черных и желтых кроликов были получены белые кролики, и все белые кролики несли доминантный черный аллель E ^D (Рисунок 3C). У кроликов белый окрас шерсти контролируется локусом C, который кодирует ген Tyrosinase ( Tyr ), а не локусом E, кодирующим MC1R (Aigner et al., 2000). Предыдущие исследования показали, что TYR является ограничивающим скорость ферментом, катализирующим меланогенез, и играет ключевую роль в биосинтезе меланина и альбинизме (Симеонов и др., 2013). Мутировавший ген Tyr привел к отсутствию пигментации из-за дефицита продукции меланина. Мы предположили, что родительские кролики несли гетерозиготную мутацию Tyr , и на фенотип альбинизма не влиял нокаут MC1R или нет.

Чтобы проанализировать исходные генотипы кроликов MC1R -KO, мы также идентифицировали генотипы MC1R родительских кроликов.Все генотипы родителей были E ^D / e, а потомство от материнского кролика № 1 показало три ожидаемых генотипа. Один из двух кроликов MC1R -KO не мог быть определен из-за делеций очень больших фрагментов в гене MC1R , но другой, изначально несущий доминантный черный аллель E ^D, был подтвержден. Из-за особенности негомологичного соединения концов (NHEJ), вызванной CRISPR / Cas9, аллели редактировались случайным образом и могут иметь разные модификации для каждого аллеля.У кроликов MC1R -KO было шесть типов модификаций, которые приводили к сдвигу рамки и преждевременному завершению, и даже часть последовательностей интронов была даже удалена. Основываясь на предсказании белка с помощью трехмерной модели, все преждевременные терминации, следовательно, приводили к усечению белка, и все пять усеченных белков не содержали по крайней мере половины ТМ-доменов. Что касается двух спонтанных мутантных белков, D ₃₀ лишен двух β-поворотов по сравнению с белком D ₆. β-Повороты играют жизненно важную роль в белках, что позволяет изменять направление полипептида в отношении фолдинга белка и молекулярного распознавания (Rose et al. , 1985). Из-за того, что белок, кодируемый аллелем е, не имеет двух β-поворотов в первой внеклеточной петле, это влияет на распознавание MC1R лигандами; таким образом, была нарушена активация пути производства эумеланина. Разумно предположить, что разрушение TM-доменов и полного C-концевого домена, продуцируемого KO гена MC1R , разрушило структуру рецептора в большей степени, что привело к большему количеству функциональных дефектов MC1R.

MC1R участвует в синтезе меланина, связываясь с двумя лигандами: α-MSH и ASIP (Choudhary et al., 2016). Комбинация α-MSH с MC1R активирует систему аденилатциклазы, увеличивает уровень циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), а затем способствует синтезу эумеланина и ингибирует выход феомеланина, тогда как связывание ASIP с MC1R снижает конститутивную передачу сигналов в Путь цАМФ, который приводит к снижению выработки эумеланина и увеличению выхода феомеланина, таким образом регулируя изменение цвета шерсти (Le Pape et al., 2008; Le Pape et al. , 2009). В качестве нижестоящих генов пути MC1R / cAMP MITF (Steingrimsson et al., 2004; Levy et al., 2006), TYR (Wang and Hebert, 2006; Ando et al., 2007), TYRP1 (del Marmol and Beermann, 1996; Lai et al., 2018) и DCT ( Aroca et al., 1992; Guyonneau et al., 2004) гены были очень важны в пути меланогенеза (рис. 6D). Мы продемонстрировали, что путь MC1R / cAMP был нарушен, а дисфункциональный MC1R приводит к разной степени снижения экспрессии этих генов у кроликов MC1R -KO по сравнению с диким желтым кроликом (рис. 6C).Этот результат разумно объяснил светло-желтый фенотип кроликов MC1R -KO на молекулярном уровне.

Заключение

Таким образом, новый бледно-желтый цвет шерсти у кроликов MC1R -KO был получен путем прерывания гена MC1R в BR с помощью системы CRISPR / Cas9. Наша работа продемонстрировала, что ген MC1R кролика играет жизненно важную роль в определении цвета шерсти, а нарушение гена MC1R изменит цвет шерсти. Кролики, редактирующие ген, с новым окрасом шерсти могут быть использованы в качестве модели для дальнейшего изучения механизмов функции гена MC1R . Кроме того, наше исследование заложило основу использования системы CRISPR / Cas9 для искусственного получения животных с популярными или новыми цветами шерсти.

Доступность данных

Все наборы данных для этого исследования включены в рукопись и дополнительные файлы.

Заявление об этике

Кроликов, использованных в настоящем исследовании, регулярно кормили в Центре лабораторных животных Университета Гуанси.Все экспериментальные исследования были одобрены и рассмотрены Комитетом по уходу и использованию экспериментальных животных Университета Гуанси (код разрешения: GXU2019-029). В настоящем исследовании эксперимент на кроликах проводился в соответствии с Основным руководством по использованию лабораторных животных и уходу за ними.

Вклад авторов

NX, DS и QL разработали и разработали эксперименты. NX, HL, SZ, XS и YZ проводили эксперименты. NX проанализировал данные, а LS написал рукопись. KC отредактировал рукопись.Все авторы прочитали и одобрили окончательную версию рукописи.

Финансирование

Настоящее исследование было предоставлено и поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (гранты № 31772597 и 31860638), и мы также благодарны Фонду естественных наук Гуанси (гранты № AA17204051 и AB16380042).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарны за техническую поддержку Государственной ключевой лаборатории по сохранению и использованию субтропических агробиоресурсов. Мы также благодарим Центр лабораторных животных Университета Гуанси за предоставление экспериментальных кроликов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www. frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2019.00875/full#supplementary-material

Ссылки

Ando, H., Кондо, Х., Ичихаши, М., Слух, В. Дж. (2007). Подходы к идентификации ингибиторов биосинтеза меланина через контроль качества тирозиназы. Журнал следственной дерматологии 127 (4), 751–761. doi: 10.1038 / sj.jid.5700683

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Aroca, P., Solano, F., Salinas, C., Garcia-Borron, J. C., Lozano, J. A. (1992). Регуляция финальной фазы меланогенеза у млекопитающих. Роль дофахромовой таутомеразы и соотношение между 5,6-дигидроксииндол-2-карбоновой кислотой и 5,6-дигидроксииндолом. евро. J. Pharmacol. 208 (1), 155–163. doi: 10.1111 / j.1432-1033.1992.tb17169.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chhajlani, V., Xu, X., Blauw, J., Sudarshi., S. (1996). Идентификация остатков связывания лиганда во внеклеточных петлях рецептора меланокортина 1. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 219 (2), 521–525. doi: 10.1006 / bbrc.1996.0266

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Choudhary, R., Kumar, S., Сингх, С. В., Шарма, А. К., Гоуд, Т. С., Шривастава, А. К., и др. (2016). Проверка предполагаемых эталонных генов для исследований экспрессии генов в клетках меланоцитов Bos indicus, подвергнутых тепловому стрессу и обработанных альфа-МСГ, с использованием количественной ПЦР в реальном времени. Мол. Сотовые зонды. 30 (3), 161–167. doi: 10.1016 / j.mcp.2016.03.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Cone, R. D., Lu, D. S., Koppula, S., Vage, D. I., Klungland, H., Boston, B., et al. (1996).«Рецепторы меланокортина: агонисты, антагонисты и гормональный контроль пигментации», в Последние достижения в исследованиях гормонов , том. 51. Под ред. Конн, П. М. (Chevy Chase: Endocrine Soc), 287–318. Материалы конференции 1995 г.

Google Scholar

Эвертс, Р. Э., Ротуйзен, Дж., Ван Ост, Б. А. (2000). Выявление преждевременного стоп-кодона в гене рецептора меланоцит-стимулирующего гормона (MC1R) у лабрадоров и золотистых ретриверов с желтой окраской шерсти. Anim. Genet. 31 (3), 194–199. doi: 10.1046 / j.1365-2052.2000.00639.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fontanesi, L., Beretti, F., Riggio, V., Dall’Olio, S., Gonzalez, E.G., Finocchiaro, R., et al. (2009). Миссенс и нонсенс мутации в гене рецептора меланокортина 1 (MC1R) у разных пород коз: связь с фенотипами красного и черного окраса шерсти, но с неожиданными доказательствами. BMC Genet. 10, 47. doi: 10.1186 / 1471-2156-10-47

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fontanesi, L., Таццоли, М., Беретти, Ф., Руссо, В. (2006). Мутации в гене рецептора меланокортина 1 (MC1R) связаны с окрасом шерсти домашнего кролика (Oryctolagus cuniculus). Anim. Genet. 37 (5), 489–493. doi: 10.1111 / j.1365-2052.2006.01494.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Fox, R. R. (1994). «Таксономия и генетика», в Биология лабораторного кролика , 2-е изд. Ред. Мэннинг, П. Дж., Ринглер, Д. Х., Новичок, К. Э.(Сан-Диего: Academic Press), 1-26.

Google Scholar

Frandberg, P. A., Doufexis, M., Kapas, S., Chhajlani, V. (2001). Остатки цистеина участвуют в структуре и функции рецептора меланокортина 1: замена остатка цистеина во втором трансмембранном сегменте превращает агонист в антагонист. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 281 (4), 851–857. doi: 10.1006 / bbrc.2001.4429

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гарсия-Боррон, Дж.К., Санчес-Лаорден, Б. Л., Хименес-Сервантес, К. (2005). Структура рецептора меланокортина-1 и функциональная регуляция. Pigment Cell Res. 18 (6), 393–410. doi: 10.1111 / j.1600-0749.2005.00278.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Guyonneau, L., Murisier, F., Rossier, A., Moulin, A., Beermann, F. (2004). У мышей с нокаутом дофахромовой таутомеразы затрагиваются меланоциты и пигментация. Мол. Cell Biol. 24 (8), 3396–3403. DOI: 10.1128 / MCB.24.8.3396-3403.2004

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Joerg, H., Fries, H.R., Meijerink, E., Stranzinger, G.F. (1996). Красный цвет шерсти крупного рогатого скота голштинской породы связан с делецией в гене MSHR. Мамм. Геном 7 (4), 317–318. doi: 10.1007 / s0033590